Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Preparación de la configuración de MEA
>Nota: Comience 15 minutos antes de grabar.
- Transfiera el volumen restante de 4AP-ACSF (líquido cefalorraquídeo artificial 4-aminopiridina) a un matraz Erlenmeyer de 500 mL.
- Coloque el matraz Erlenmeyer en un estante encima del amplificador MEA (matrices de microelectrodos) y utilice un tubo para permitir que la solución alimente continuamente una jeringa de 60 ml. Ajuste la altura del matraz Erlenmeyer y de la jeringa para permitir una tasa de alimentación por gravedad de 1 mL/min.
nota: La altura correcta depende del diámetro interior de la tubería (ID). Para tubos de 5/32 pulgadas de diámetro interior, 30 cm son suficientes.
- Comience a burbujear el 4AP-ACSF en el matraz Erlenmeyer y en la jeringa con una mezcla de gas 95% O2/5% CO2.
- Deje que el 4AP-ACSF fluya a través del tubo de perfusión hacia un vaso de precipitados hasta que no haya aire en el interior; luego detenga el flujo de la solución.
- Conecte el elemento calefactor en la base MEA al termostato. Coloque el chip MEA seco dentro del amplificador MEA y asegure el cabezal del amplificador. Una pipeta Pasteur de plástico transfiere 4AP-ACSF a la entrada y al depósito exterior de la cámara de registro.
- Asegure la cánula calefactora a un soporte magnético y coloque su punta dentro del puerto de entrada de la cámara de grabación. Conecte el soporte magnético a una tira magnética en el cabezal del amplificador MEA. Conecte el tubo de perfusión a la cánula. Conecte la cánula al termostato.
nota: La cánula de calentamiento debe estar cubierta por un tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) biselado para llegar al puerto de entrada de la cámara de grabación y minimizar el ruido debido a su material metálico. Cuando el depósito de entrada está adecuadamente lleno con 4AP-ACSF, las gotas que caen del sistema de perfusión no deben ser visibles.
- Coloque la aguja de succión dentro del depósito y verifique que haya presión negativa sumergiéndola en el ACSF; verifique si hay un ruido de succión constante de baja frecuencia><.
nota: La aguja de succión debe colocarse de manera que el 4AP-ACSF fluya justo por encima de la superficie del corte de cerebro. Se puede utilizar una línea de vacío o una bomba de vacío de bajo ruido.
- Configure el regulador de flujo para permitir un caudal de 1 mL/min y comience a perfundir.
nota: La perfusión alimentada por gravedad elimina el ruido que podrían causar las bombas peristálticas; Si se prefieren las bombas peristálticas, son obligatorios los modelos de bajo ruido.
- Una vez que 4AP-ACSF esté fluyendo a través de la cánula, encienda el termostato. Ajuste la cánula de calentamiento a 37 °C y la base MEA a 32 °C para lograr una temperatura de 32 a 34 °C dentro de la cámara >NOTA: ¡ATENCIÓN! Nunca caliente la cánula sin solución o podría dañarse irreversiblemente. Ajuste la temperatura de la cánula por encima de la temperatura de registro (es decir, 32 - 34 °C) para tener en cuenta el desfase de temperatura intrínseco entre el valor establecido y el valor real en la punta de la cánula de calentamiento y dentro de la cámara de registro. El caudal, la temperatura ambiente y el volumen de la cámara de registro influyen en la temperatura de la solución de registro. La configuración informada en el paso 1.9 está optimizada para el protocolo y el equipo descritos. Compruebe siempre la temperatura de grabación real con un termopar y ajuste la configuración según sea necesario. No caliente la base MEA por encima de 34 °C para evitar el sobrecalentamiento de la rebanada de cerebro.
- Coloque el electrodo de referencia externo en el depósito de entrada de la cámara de registro.
nota: Aunque los chips MEA están equipados con un electrodo de referencia interno, la cámara de registro personalizada lo cubre. Por lo tanto, se debe utilizar un electrodo de referencia externo. Un pellet saturado de KCl (cloruro de potasio) es el más práctico ya que está listo para usar sin necesidad de cloración.
>2. Mapeo en vivo de MEA
- Una vez que el nivel 4AP-ACSF y la temperatura de registro se estabilicen como se desee, gire las llaves de paso de perfusión y succión a la posición de apagado para detenerlas temporalmente.
- Transfiera rápidamente un trozo de cerebro a la cámara de grabación MEA con una pipeta Pasteur de vidrio invertido. Ajuste su posición en el área de registro MEA según sea necesario utilizando una pipeta Pasteur rizada pulida al fuego (Figura 1C) o un cepillo suave y compacto. Coloque el anclaje de sujeción (Figura 1D) en el corte de cerebro. Reinicie la perfusión y la succión girando sus llaves de paso a la posición de encendido.
NOTA: ¡CRÍTICO! El corte debe transferirse y la perfusión debe reiniciarse dentro de los 60 s, o el tejido podría morir. El anclaje de sujeción del corte debe mantenerse en 4AP-ACSF para evitar que el corte de cerebro se mueva mientras se coloca el anclaje en el corte de cerebro debido a las diferencias en la tensión superficial. El anclaje para asegurar el corte de cerebro en el MEA puede fabricarse a medida con alambre de acero inoxidable e hilo de nailon (Figura 1D) u obtenerse de fuentes comerciales. La Figura 1E muestra la configuración experimental final con el chip MEA conectado a la cabeza del amplificador: un corte de cerebro que descansa sobre el chip MEA dentro de la cámara de grabación se mantiene presionado por el ancla personalizada. El electrodo de referencia (círculo rojo) y el tubo de PTFE que cubre la cánula de calentamiento (flecha roja) se colocan en el depósito de entrada, mientras que la aguja de succión (flecha azul) se coloca en el depósito de salida.
- Tome una fotografía del corte de cerebro con una cámara montada en una platina de microscopio invertido.
- Ejecute el script mapMEA en el software del ordenador para iniciar la GUI para mapear los electrodos.
nota: El software hecho a medida permite al usuario seleccionar los electrodos que corresponden a estructuras específicas del corte de cerebro. Este paso es crucial para activar la vía correcta y suprimir la actividad ictal mediante el uso de la estimulación eléctrica.
- Haga clic en el botón Examinar para cargar la imagen del corte de cerebro. Asegúrese de que el electrodo de referencia aparezca en la fila superior de la mitad izquierda del MEA (Figura 2A, marca de triángulo). Haga clic en el botón Activar puntero y, a continuación, seleccione los electrodos superior e inferior en la fila más a la izquierda de la matriz para marcar las coordenadas XY para el enderezamiento de la imagen y el mapeo de electrodos.
- En el menú desplegable Tipo de sector, seleccione Horizontal. Marque la casilla de verificación Estructuras predeterminadas.
nota: Es posible personalizar las estructuras seleccionando el botón Introducir nuevas estructuras. Las estructuras predeterminadas para el corte horizontal de cerebro se muestran en la Figura 2A.
- Usando los pulsadores numerados debajo de la imagen del corte de cerebro, seleccione los electrodos correspondientes al ROI y haga clic en el pulsador correspondiente en el panel de estructuras para asignarlos (Figura 2B); repita este paso para cada ROI.
- Pulse el botón Guardar: el software genera una carpeta de resultados llamada #EXP_LabelledElectrodes que contiene una tabla que informa de los electrodos seleccionados y los ROI.
>3. Registro y modulación eléctrica de la actividad epileptiforme
- Deje que el corte de cerebro se estabilice dentro de la cámara de grabación durante 5 a 10 minutos antes de grabar.
- Encienda la unidad de estímulo al menos 10 minutos antes del protocolo de estimulación para permitir la autocalibración y estabilización. Inicie el software de control de estímulos y verifique que el estimulador y el amplificador MEA estén conectados correctamente, como lo indica un LED verde en el panel principal del software de control de estímulos.
- Configura la estimulación en una configuración bipolar. Seleccione los pares de electrodos en contacto con la capa de células piramidales del CA1/subículo proximal (cf.24,25) entre los mapeados con el script mapMEA (cf. sección 12). Utilice un cable para conectar uno de los electrodos seleccionados al conector negativo del estimulador y el otro electrodo al conector positivo del mismo canal del estimulador. Use otro cable para conectar la tierra del estimulador a la tierra del amplificador.
- Inicie el software de grabación. Para adquirir datos, presione el botón PLAY en el panel principal del software de grabación. Registre al menos 4 secreciones ictales.
nota: Una frecuencia de muestreo de 2 kHz permite adquirir potenciales de campo con una resolución justa al tiempo que minimiza el uso de espacio en el disco duro. Un archivo de grabación de 5 minutos ocupa ~80 MB. Es posible que se requieran frecuencias de muestreo más altas, por ejemplo, para registrar artefactos de estímulo o actividad de varias unidades. Para observar solo los potenciales de campo, use un filtro de paso bajo en vivo a 300 Hz para cortar la actividad de varias unidades.
- Determina la intensidad del estímulo.
- En el software de control de estímulos, utilice el panel principal para diseñar una duración de pulso de corriente positiva-negativa bifásica cuadrada de 100 μs/fase.
NOTA: ¡ATENCIÓN! La estimulación de corriente continua requiere un pulso de carga equilibrado para evitar dañar el equipo.
- Ejecute una prueba rápida de entrada/salida (E/S) para identificar la mejor intensidad de estímulo. Administre el pulso de estimulación diseñado en el paso 3.5.1 a 0,2 Hz o menos añadiendo un intervalo entre impulsos de 5 s o más en la forma apropiada del software de control de estímulos. En la pestaña de amplitud de pulso, introduzca una amplitud de pulso inicial de 100 μA/fase y aumente en pasos de 50 a 100 μA en cada ensayo hasta que la estimulación pueda evocar de forma fiable eventos interictales en las cortezas parahipocampales (compruebe las señales visualizadas por el software de registro).
- Modulación eléctrica de la ictogénesis límbica
- Programe la unidad de estímulo para que entregue el protocolo de estimulación de interés. Utilice la amplitud del estímulo identificada durante la prueba de E/S.
nota: La tasa de fracaso de las respuestas evocadas debe ser del ≤20 %.
- Después de que se detenga la estimulación, verifique la recuperación de la red a la condición previa al estímulo registrando al menos 4 descargas ictales (como en el paso 3.4).
