1. Construyendo un Campo de Comportamiento y Preparando el Hardware para Permitir la Estimulación Optogenética en el Campo del Comportamiento
- Para construir una arena de comportamiento con privación de luz, construya una caja con una dimensión de 89 x 61 x 66 cm3 (35" de largo x 24" de ancho x 26" de alto) hecha de láminas acrílicas de plexiglás de color negro (3 mm de grosor) (consulte la tabla de materiales). Los materiales para construir una caja de este tipo deben estar disponibles en las ferreterías locales. Coloque esta caja sobre una mesa en la sala de comportamiento (Figura 1A).
- Monta una cámara monocromática de bus serie universal (USB) 3.0 con dispositivo de carga acoplada (CCD) equipada con un filtro infrarrojo (IR) de paso largo de 830 nm y un objetivo de 8 mm F1.4 con montura C (ver Tabla de materiales) en el centro del techo de la caja negra. Coloque dos tiras de diodos emisores de luz infrarroja (LED) (ver Tabla de Materiales) sobre la mesa para iluminar las larvas en la arena oscura (Figura 1A).
- Para construir la plataforma LED, obtenga una placa de aluminio cuadrada de 22 cm × 22 cm (preferiblemente pintada con aerosol con un acabado negro mate para eliminar cualquier reflejos). En el centro de la placa, con un cortador de metal, corte un agujero que sea lo suficientemente grande como para caber alrededor de la cámara CCD.
- Cubra la placa de metal con tiras de luces LED rojas (consulte la tabla de materiales). Suelde los cables de tiras de luz LED en serie y alimente los cables de tira a un relé optoacoplador controlado por un microprocesador Raspberry Pi 2B (consulte la Tabla de materiales) (Figura 1B y 2).
- Instale y configure el sistema operativo basado en Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux en el procesador Raspberry Pi antes de conectar el relé optoacoplador a las tiras de LED. Conecte una fuente de alimentación para alimentar las tiras de LED y el optoacoplador (Figura 2) (consulte la Tabla de materiales). Monte la plataforma LED alrededor de la cámara CCD (Figura 1B).
nota: El sistema operativo Ubuntu Mate v16.04 está disponible de forma gratuita. Un conjunto de comandos simples basados en Python se puede adaptar fácilmente para programar patrones de estímulos de luz LED (ver archivo de sintaxis).
- Asegure una irradiancia homogénea en varios puntos del ámbito del comportamiento. Mida la irradiancia absoluta en la superficie de la arena con la ayuda de un espectrómetro y determine que es de ~ 1.3 W / m2 en toda la superficie de la arena><.
nota: A esta intensidad, no se observaron cambios significativos en la temperatura en el transcurso de los experimentos. Otro estudio utilizó una irradiancia más alta de ~1,9 W/m2 y no observó cambios en la temperatura en el transcurso de los experimentos.
>2. Preparación de larvas de Drosophila para análisis de comportamiento
- Mantenga las moscas en alimento estándar para moscas (ver Tabla de Materiales) a 25 °C, 50-60% de humedad relativa (HR) y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.
- Con el fin de expresar CsChrimson en un solo par de ORNs, cruza hembras vírgenes de una línea UAS-IVS-CsChrimson con machos de una línea OrX-Gal4 ('X' corresponde a uno de los 21 genes del receptor de olor (O) de larvas que se expresan de forma única en cada uno de los 21 pares de ORNs).
- Alternativamente, con el fin de expresar CsChrimson en las 21 ORNs larvarias, se cruzan hembras vírgenes de una línea UAS-IVS-CsChrimson con machos de una línea Orco-Gal4 ('Orco' es el co-receptor que se expresa en las 21 ORNs).
- Utilice la línea UAS-IVS-CsChrimson por sí misma como control en estos experimentos.
nota: Las existencias de moscas enumeradas aquí están disponibles en el Centro de Existencias de Drosophila de Bloomington (consulte la Tabla de Materiales).
- Una vez que las moscas macho y hembra en un cruce pueden aparearse y poner huevos durante 48 h, transfiera los adultos a un vial fresco.
- A la superficie del vial alimenticio que contiene huevos, añadir 400 μL de una mezcla que contenga 400 μM de retinal todo-trans (ATR) disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) y 89 mM de sacarosa disuelta en agua destilada><.
nota: La pequeña cantidad de sacarosa promueve la alimentación larvaria de la solución ATR. ATR es un cofactor necesario para la regulación positiva de la expresión de CsChrimson. ATR es sensible a la luz.
- Una vez que se agrega ATR a los viales de alimentos que contienen huevos, incube los viales en la oscuridad durante 72 h.
adicionales
NOTA: Si bien este estudio y los dos anteriores no han observado efectos sobre el comportamiento de las larvas debido a la alimentación con ATR, se recomienda controlar los efectos de la alimentación con ATR sometiendo las líneas de prueba a la misma cantidad de la mezcla anterior que no contiene ATR.
- Extraiga las larvas del tercer estadio (~ 120 h después de la puesta de huevos) de la superficie de la comida para moscas flotándolas con una solución de sacarosa de alta densidad (15%). Con una micropipeta P1000, separe las larvas que flotan en la superficie de la solución de sacarosa en un vaso de precipitados de vidrio de 1000 mL.
- Lave las larvas 3-4 veces intercambiando 800 ml de agua fresca destilada en el vaso de precipitados de vidrio cada vez. Deje que las larvas descansen durante 10 minutos antes de someterlas al ensayo de comportamiento.
>3. Ensayo de comportamiento
- Mantenga una temperatura constante (entre 22 y 25 °C) y humedad (entre 50 y 60 % de humedad relativa) en la sala de comportamiento.
- Prepare el medio rastrero para larvas vertiendo 150 mL de agarosa derretida (1,5%) en una placa de Petri cuadrada de 22 cm x 22 cm. Se vierte una placa de Petri por cada ensayo del ensayo, de 8 a 10 ensayos por experimento. Deje que la agarosa se solidifique y se enfríe durante 1-2 h en las placas de Petri antes de usarlas en el ensayo de comportamiento.
- Transfiera no más de 20 de las larvas del tercer estadio preparadas al centro de la placa de Petri (Figura 1C). Cubre la placa de Petri con su tapa. Coloque la placa de Petri en la arena de comportamiento debajo de la cámara CCD.
nota: Dependiendo del experimento, los ensayos de comportamiento suelen llevarse a cabo durante 3-5 minutos. Si se utiliza un odorante en el ensayo para proporcionar pistas de orientación, se ha observado que el gradiente de olor resultante permanece estable durante aproximadamente 5 minutos. No se recomiendan tiempos de ensayo más largos. No se han observado efectos deletéreos en las larvas debido a la deshidratación o a la exposición prolongada a la luz roja de 630 nm dentro de estos puntos de tiempo.
- Encienda la fuente de luz LED infrarroja de 850 nm para visualizar las larvas en el video. Encienda la cámara CCD para registrar el movimiento de las larvas.
- Utilizando el software asociado con el procesador Raspberry Pi, programe el procedimiento para administrar patrones apropiados de estimulación de luz roja.
nota: Un conjunto de comandos simples basados en Python se puede adaptar fácilmente para programar patrones de estímulos de luz LED (ver archivo de sintaxis).
