Inhibición mediada por microARN de las corrientes postsinápticas excitatorias en cortes de hipocampo de ratón

Resumen

Fuente: Thalhammer, A., et al. Combinación de optogenética con microARN artificiales para caracterizar los efectos de la eliminación de genes en la función presináptica dentro de circuitos neuronales intactos. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la inhibición mediada por microARN de las corrientes sinápticas excitadoras en cortes de cerebro de hipocampo de ratón. Las neuronas CA3 se infectaron con un vector viral recombinante que alberga una construcción para expresar un indicador fluorescente, un canal de membrana activado por luz y un microARN que regula a la baja la expresión de los canales de calcio dependientes de voltaje. Al colocar un corte en una cámara de registro y parchear una neurona CA1 con una pipeta de registro, se utilizaron pulsos de luz para estimular el canal activado por la luz, lo que resultó en una afluencia de iones y generó un potencial de acción. La ausencia de canales de calcio dependientes de voltaje en las neuronas CA3 inhibe la liberación de neurotransmisores, lo que provoca la inhibición de las corrientes postsinápticas excitadoras en las neuronas CA1 conectadas sinápticamente.

Protocolo

>1. Evaluación del papel de las proteínas presinápticas en circuitos neuronales intactos mediante la estimulación dirigida de neuronas derribadas con optogenética

NOTA: El siguiente protocolo requiere experiencia previa con registros electrofisiológicos en cortes agudos de cerebro y acceso a una configuración electrofisiológica.

1. Inyectar estereotácticamente virus adenoasociados recombinantes con serotipo mosaico 1 y 2 (rAAV1/2) en el cerebro. Determine las coordenadas estereotácticas para la región cerebral de interés utilizando atlas estereotácticos para el cerebro de ratón o rata.
   1. Utilice un extractor de micropipetas para extraer micropipetas de inyección con vástagos largos de Ø 7-9 μm; sujete las micropipetas de inyección en los vástagos con unas tijeras. Utilice un rotulador fino y papel cuadriculado para colocar marcas de calibración en las micropipetas de inyección cada 2 mm.
   2. Anestesiar al animal con isoflurano y fijarlo en el aparato estereotáctico.
   3. Mantenga al animal caliente durante toda la operación con una almohadilla térmica ajustada a 37 °C.
   4. Protege los ojos con lubricante ocular.
   5. Afeita el pelaje de la cabeza con una maquinilla de afeitar eléctrica.
   6. Unte povidona yodada en la cabeza afeitada con un bastoncillo de algodón.
   7. Bajo un microscopio de disección, haga una incisión en la línea media.
   8. Limpie la superficie del cráneo con un bastoncillo de algodón, para que el bregma y la lambda sean visibles.
   9. Coloque la micropipeta de inyección en su soporte. Fije el soporte al brazo estereotáctico.
   10. Determine las coordenadas x e y del lugar de inyección en relación con el bregma y/o la lambda.
   11. Use un taladro para adelgazar el cráneo sobre el área objetivo.
       nota: Use movimientos circulares suaves y evite perforar el cráneo, ya que esto dañará la superficie del cerebro.
   12. Si hay sangrado, absorba el exceso de sangre con papel de toalla.
       nota: El exceso de sangre dificultará la determinación correcta de la coordenada z.
   13. Cargue ≤2 μL de virus en la micropipeta de inyección por capilaridad.
   14. Lleve la micropipeta de inyección a las coordenadas x e y del lugar de inyección.
   15. Calcule la coordenada z a partir de la duramadre y baje la pipeta lentamente en el cerebro.
   16. Cuando se alcance la coordenada z, espere 3 minutos para permitir el ajuste del tejido.
   17. Aplique una presión positiva baja con una jeringa de 1 ml conectada a través de un tubo flexible a la parte posterior de la micropipeta de inyección. Controle visualmente la velocidad de expulsión del virus de la micropipeta de inyección a través del microscopio de disección y utilizando las marcas de calibración como puntos de referencia.
       nota: El virus debe inyectarse a una velocidad lenta (<100 nL/min) para evitar daños en los tejidos.
   18. Cuando finalice la inyección, espere 5 minutos, retire la micropipeta de inyección 0,2 mm, espere otros 5 minutos para evitar el reflujo del virus.
   19. Retire la micropipeta inyectable lenta y completamente del cerebro y deséchela en un recipiente lleno de lejía.
   20. Humedecer el cráneo con solución fisiológica y suturar la piel con 3-4 puntos.
   21. Aplique el ungüento de gentamicina en la herida.
   22. Aloje al animal en una jaula limpia con pellets de comida y bajo una lámpara de calor hasta que se recupere por completo.
2. ≥15 días después de la inyección, decapitar animales bajo anestesia profunda con isoflurano.
3. Prepare cortes agudos de la región cerebral de interés con un vibratomo utilizando una solución de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) gaseada (95% O₂, 5% CO₂), que contiene (en mM): 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH₂PO₄, 1,5 MgCl₂, 1 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 2 piruvato de sodio y 18 glucosa (osmolaridad ajustada a 300 mOsm). Por ejemplo, si el objetivo es analizar la transmisión sináptica de las neuronas piramidales CA3 a CA1, prepare cortes sagitales de la formación del hipocampo (350 μm de grosor)
   nota: A partir de este paso, se trabaja en condiciones de poca luz para evitar la activación de la sonda optogenética por la luz ambiental.
4. Deje que las rodajas se recuperen durante 30 minutos a 37 °C en el mismo aCSF en una cámara diseñada para contener cortes de cerebro. Mantenga los cortes en la misma cámara de corte de cerebro a temperatura ambiente hasta el registro.
   nota: Con estas condiciones, las rodajas se pueden mantener saludables hasta por 6 a 8 horas.
5. Transfiera un corte a una cámara de registro sumergida y superfundíquelo con 2 mL/min del mismo aCSF utilizado para la recuperación suplementado con 1,5 mM de CaCl₂ (Ca²⁺ total: 2,5 mM) y sin piruvato de sodio.
   nota: Las lonchas se preparan y mantienen en baja concentración de^Ca2+ (1 mM) para minimizar la toxicidad. Las grabaciones se realizan en 2,5 mM Ca²⁺ para favorecer la liberación de las vesículas.
6. Compruebe brevemente la señal del indicador fluorescente expresado (p. ej. TdTomate; Figura 1B) para determinar la localización e intensidad de la infección.
7. Llene un electrodo de parche con una solución intracelular que contenga (en mM): 110 K-gluconato, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 etilenglicol-bis(β-aminoethil éter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA), 3 MgCl₂, 4 adenosina 5′-trifosfato sal magnésica (Mg-ATP), 0,5 Guanosina 5'-trifosfato sal trisódica (Na 3-GTP), 20 K₂-fosfato de creatina, tampón de ácido 10 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico ajustado con KOH (HEPES-KOH, pH 7,28, 290 mΩ).
   nota: Utilice un electrodo de parche con una resistencia de pipeta de 5-6 mΩ.
8. Bajo iluminación infrarroja, alcanza una configuración de célula completa hermética de una neurona que recibe entradas sinápticas de las neuronas infectadas. Por ejemplo, si las neuronas piramidales CA3 estaban infectadas, se colocan un parche en las neuronas piramidales en el tracto proximal y medial de la región CA1 (Figura 1C).
   nota: La resistencia en serie puede dejarse sin compensar, pero debe ser constante y baja (≤20 MΩ).
9. Utilice la farmacología para aislar las corrientes sinápticas que se están investigando. Por ejemplo, si el objetivo es investigar la transmisión sináptica excitatoria, bloquee la transmisión sináptica inhibitoria con bicuculina de 10 μM.
10. Evocar corrientes sinápticas, por ejemplo, corrientes postsinápticas excitatorias (EPSC), utilizando un láser azul de 473 nm acoplado a una fibra óptica (Ø ≤250 μm) colocada en el somata de las neuronas infectadas (p. ej. Neuronas piramidales CA3).
    1. Ajuste la duración de la estimulación al mínimo, para reducir la posibilidad de evocar más de un potencial de acción por pulso de luz. Si usa ChETA, configúrelo en 2 ms.
    2. Ajuste la fuerza de estimulación del láser para producir corrientes sinápticas pequeñas pero claramente detectables (amplitud máxima de ≤50 pA para EPSC registradas a un potencial de retención de -70 mV entre las neuronas piramidales CA3 y CA1; Figura 1D). Si se utiliza ChETA y una fibra óptica de 250 μm de diámetro, deberían ser adecuadas fuerzas de estimulación de 1-3 mW a la salida de la fibra.
       NOTA: si no se puede regular la intensidad del láser, utilice filtros de densidad neutra.
    3. Ilumina con la luz láser de 473 nm los somas de las neuronas infectadas, pero no sus axones. Por ejemplo, haga brillar la luz sobre el CA3 somata, y lejos de los colaterales de Schaffer, para evitar la despolarización directa de los axones.
    4. Aplique tetrodotoxina (TTX; 0,5 μM), un bloqueador de los canales de sodio, a la muestra para confirmar que los canales están impulsados por el potencial de acción.
    5. En diferentes grabaciones, aplique un bloqueador selectivo a la corriente sináptica bajo investigación para confirmar que la estimulación es selectiva.
       nota: Por ejemplo, aplique 2,3-dioxo-6-nitro-7-sulfamoil-benzo[f]quinoxalina (NBQX, 10 μM) a las EPSC mediadas por receptores de glutamato de tipo α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA).
    6. Comparar las corrientes sinápticas evocadas óptica y eléctricamente en el mismo corte agudo del cerebro en respuesta a la estimulación repetitiva (estímulos ≥2 a ≤20 Hz). Se debe observar un grado similar de facilitación sináptica o depresión entre la estimulación eléctrica y la óptica cuando se utiliza un microARN de control (miR), lo que sugiere que los dos tipos de estimulaciones activan mecanismos celulares similares><. nota: Los pasos anteriores son necesarios para garantizar que la estimulación óptica no induzca una despolarización directa de los botones presinápticos, evitando así algunos mecanismos de transmisión sináptica.

Resultados

Figura 1. Evaluación del papel de Ca_v2.1 [EFa] y Ca_v2.1 [EFb] en el hipocampo nativo mediante la estimulación dirigida de neuronas derribadas con optogenética. (A) Esquema del casete de expresión de las construcciones rAAV utilizadas para la infección in vivo. (B) Sección del hipocampo que muestra que la fluorescencia de TdTomato se lim...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cortes de cerebro Precámara	Aparato de Harvard	BSC-PC
Generador de imágenes basado en cámara CCD	Bio-Rad	ChemiDoc™ MP
Reactivos de cultivo celular	Tecnologías de la Vida
perforar	Premonición	K.1030
EGTA	sigma	E4378
Pomada de gentamicina	Farmacia local
glucosa	sigma	G7021
HEPES	sigma	54459
Micropipetas de inyección	Narishige	GD1
Sales inorgánicas y detergentes	sigma
K 2-fosfato de creatina	Calbiochem	237911
KGluconato	Fluka	60245
láser	Tecnologías Laserglow	LRS-0473-GFM-00100-03
membrana	Amersham	Protran™ 0,2 μm NC
MgATP	sigma	A9187
Soporte para micropipetas	Narishige	IM-H1
Extractor de micropipetas	Narishige	PC-100
Na3GTP	sigma	G8877
NaPiruvato	sigma	P5280
Lubricante ocular	Farmacia local	Lacrigel
Povidona yodada	Farmacia local	Betadine
Aparato estereotáxico	WPI (en inglés
Tetrodotoxina	Tocris	Año 1069	nocivo
Vibratomo	Leica	VT1200S