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Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Carga de colorante de calcio
- Seleccione los tintes de calcio según la preferencia del investigador individual. Aquí usamos Fluo-8AM o Fluo-4AM. Sin embargo, este método también se puede aplicar a otros colorantes: disuelva los colorantes de calcio en DMSO en una solución de 1 mM y copolímeros en bloque al 1% (por ejemplo, ácido plurónico-127) hasta un volumen final de 50 μL y sonicato durante 10 min.
- Añada solución a aCSF hasta una concentración final de 10 μM, 0,01% de copolímeros en bloque para cortes de cerebro.
- Para animales adultos (>12 semanas), pipetear los tintes (50 μL) directamente sobre las rodajas de cerebro y mantener durante 75 minutos para permitir una mejor penetración del colorante en las capas profundas.
- Para asegurar una oxigenación adecuada del corte sumergido durante la incubación del colorante, prepare una cámara de carga de vidrio con una tapa cerrada (frasco circular de 2,5 cm de diámetro, 3,5 cm de altura) con colorantes de calcio diluidos en 2,5 mL de aCSF. Oxigenar continuamente con 95% O2/5% CO2. No burbujee.
- Después de la carga de colorante, lavar el tejido con aCSF y transferirlo al sistema de incubación, reduciendo lentamente la temperatura a 15 - 16 °C hasta que esté listo para uso experimental.
>2. Registros electrofisiológicos e imágenes
- Coloque tejido en una cámara de registro sumergida bajo un microscopio y perfunde con aCSF oxigenado a un caudal de 4 a 5 mL/min, ya sea a RT (~22 °C) o a temperatura fisiológica (~35 °C). Sostenga el pañuelo en su lugar usando un "arpa" hecha a medida, hecha de hilos de nailon o oro estirados y pegados a través de una pieza de alambre de oro o platino en forma de U.
- Para electrofisiología:
- Prepare pipetas de grabación a partir de vidrio de borosilicato de 1,5 mm (1,19 mm de diámetro interior) utilizando un extractor de micropipetas para lograr una resistencia final de 5-6 MΩ.
- Llene la pipeta con 3 - 4 μL de solución interna y visualice las células bajo contraste de interferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC) utilizando una cámara CCD. La solución intracelular debe adaptarse cuidadosamente a cada experimento para lograr resultados experimentales.
- Coloque la pipeta mientras mantiene la presión positiva aplicada a través de un puerto de succión en el soporte de la pipeta en la membrana de una celda mediante un micromanipulador. No es necesario un raspado previo de la membrana, ya que el ILM se ha extraído de la retina. Una vez que la pipeta esté en la celda, aplique una suave presión negativa a la pipeta para lograr un sellado de gigaohmios. Luego, rompe la membrana celular con una breve cantidad de presión negativa.
- Realice registros de pinza de corriente o voltaje de celda completa utilizando técnicas estándar, según corresponda.
- Imágenes de calcio:
- Para una sola longitud de onda de excitación de Fluo-4, filtre la luz de excitación a través de un filtro de paso de banda de 460 a 490 nm y la luz emitida a través de un filtro de paso de banda de 515 a 550 nm. Utilice una cámara digital de alta velocidad para obtener la grabación más rápida y sensible. Adquiera imágenes según sea necesario.
- Mida las alteraciones en la fluorescencia en función del tiempo, ya sea en una sola longitud de onda (Fluo-4).