Prueba de conexiones monosinápticas utilizando tetrodotoxina y canales de sodio resistentes a la tetrodotoxina

Resumen

Fuente: Zhang, X. et al., Examinando las conexiones monosinápticas en Drosophila utilizando canales de sodio resistentes a la tetrodotoxina. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra cómo probar conexiones monosinápticas usando una mosca transgénica. La mosca tiene canales de sodio resistentes a la tetrodotoxina y canales activados por luz roja en sus neuronas presinápticas, que están optogenéticamente excitadas para transmitir señales a las neuronas postsinápticas.

Protocolo

1. Preparar moscas e identificar las líneas promotoras de GAL4

1. Seleccione una línea promotora de GAL4 y crúcela con moscas portadoras del transgén UAS-NaChBac y un transgén optogenético para la activación.
   nota: UAS-CsChrimson se selecciona debido a su alta conductancia y la facilidad con la que activa los potenciales de acción mediados por el canal de sodio resistente a la tetrodotoxina (TTX) (NaChBac). Tanto UAS-NaChBac como UAS-CsChrimson están disponibles en el Repositorio de Acciones de Bloomington.
2. Prepare el retinal totalmente trans como solución madre en etanol (35 mM) y almacene la solución en el congelador a -20 °C.
3. Mezcle 28 μL de este caldo en aproximadamente 5 mL de alimento en hojuelas de papa rehidratado y agregue esta mezcla a la parte superior de un vial de medio convencional de Drosophila.
4. Cría moscas adultas que expresen csChrimson con alimentos que contengan 0,2 mM de contenido trans-retiniano durante 1 a 3 días.

>2. Preparar acciones TTX

1. Cree una solución madre de 1 mM TTX en agua destilada o desionizada. Guarde esta solución en un refrigerador de laboratorio durante varios meses. Consulte las políticas de la institución con respecto al almacenamiento de TTX, ya que muchas instituciones clasifican el TTX como una sustancia peligrosa o controlada.

>3. Preparar moscas para la electrofisiología

1. Recoja moscas adultas de 1 a 3 días de edad que se críen en la comida con todo el retinal.
2. Coloque las moscas en un frasco de centelleo de vidrio. Coloque el vial sobre hielo durante 1 minuto para inmovilizar las moscas.
3. Use pinzas gruesas para insertar una mosca en una cámara de grabación hecha a medida. La cámara consiste en un círculo de 3 1/2" cortado con láser de acrílico de 1/16". Corta un agujero de 3/4" en el centro, donde se une una lámina personalizada con epoxi de 2 partes. La lámina contiene una esperanza de forma triangular en la que se inserta la mosca.
4. Aplique cera o epoxi curable ultravioleta (UV) alrededor del animal para asegurarlo firmemente dentro de la cámara de registro.
5. Iluminar la preparación con un cuello de cisne de fibra óptica para su visualización bajo un microscopio estereoscópico. Ajuste las fibras del cuello de cisne para una iluminación oblicua ajustándolas de modo que iluminen la mosca directamente desde el lado.
6. Ajuste el nivel de luz a la configuración más baja posible que aún permita una visualización clara de la mosca. Esta intensidad de luz variará según los experimentos individuales.
   nota: Este protocolo se puede adaptar mediante el uso de un método de explante cerebral in situ.
7. Recupere la solución salina de grabación externa. La solución salina contiene en mM: 103 cloruro de sodio, NaCl, 3 cloruro de potasio, KCl, 5 N-tris(hidroximetil)metil-2-aminoetano-ácido sulfónico, 8 trehalosa, 10 glucosa, 26 bicarbonato de sodio, NaHCO₃, 1 fosfato de dihidrógeno de sodio, NaH₂PO₄, 1,5 cloruro de calcio, CaCl₂ y 4 cloruro de magnesio, MgCl₂ (ajustado a 270-275 mΩ). La solución salina está burbujeada con un 95% de O₂/5% de CO₂ (carbógeno) y tiene un pH ajustado a 7,3.
8. Coloque 4-6 gotas de solución salina de registro extracelular sobre la preparación de mosca. En este punto, aumente el nivel de luz en el microscopio de disección para una mejor visibilidad.
9. Afila un alambre de tungsteno mediante electrólisis. Para hacer el alambre, prepare una solución saturada de nitrato de potasio, KNO₃ y aplique aproximadamente 20 V de corriente alterna (CA) mientras sumerge la punta del alambre en la solución 20 veces durante 100 ms cada una hasta que la punta esté afilada. Utilice el alambre de tungsteno afilado para eliminar la cutícula de la cabeza de la mosca y así exponer el cerebro.
10. Exponga aún más el cerebro al eliminar la tráquea y los cuerpos grasos que lo rodean. Si accede a los lóbulos de las antenas, utilice un alambre de tungsteno doblado o una herramienta similar para meter suavemente las antenas por debajo de la cámara de grabación de aluminio para aumentar la visibilidad. Use pinzas afiladas para arrancar suavemente la cubierta glial que cubre el área de interés donde se realizarán las grabaciones.
11. Transfiera la cámara de registro al equipo de electrofisiología. Iniciar inmediatamente la perfusión con registro externo de solución salina burbujeada con carbógeno para preservar el cerebro. El depósito de solución salina se coloca sobre la platina del microscopio y se alimenta por gravedad a la preparación. Utilice una línea de vacío y un matraz Erlenmeyer de 2 L para recoger la solución salina residual.

>4. Obtener una grabación de celda completa

1. Tire de las pipetas de parche en un extractor de pipetas comercial. Consulte el manual para obtener los ajustes necesarios para lograr una pipeta adecuada con una resistencia de punta cercana a 7 mΩ.
2. Añada 4 μl de solución de registro interna en una pipeta de parche. La solución salina interna consta de 140 aspartato de potasio, 10 ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES), 4 trifosfato de adenosina y magnesio (MgATP), 0,5 aguanosina 5'-trifosfato hidrato de sal trisódica (Na₃GTP), 1 ácido tetraacético de etilenglicol (EGTA) y 1 cloruro de potasio (KCl) en mM.
3. Configure el amplificador de pinza de parche para la grabación de celda completa. Ponga a cero el desplazamiento del amplificador y configure el amplificador para que entregue pulsos de prueba. En este caso, se utiliza un amplificador de pinza de parche 2.400 de AM systems.
4. Aplique presión positiva a través de la pipeta y acérquese a la célula. Utilice un micromanipulador para dirigir la pipeta y entrar en contacto con la célula. Libere la presión positiva. Ajuste el potencial de retención de la membrana a -60 mV. La pipeta debe formar un sello de gigaohmios con la membrana de la celda, como lo demuestra una corriente de retención baja por debajo del picoamperio.
   nota: Si utiliza la segmentación celular guiada por la proteína fluorescente verde (GFP), intente minimizar el uso de luz epifluorescente para prevenir la activación de ChR2 y la posible depresión sináptica. Espere también unos minutos antes de aplicar el paso 5.
5. Configure el amplificador para que entregue pulsos de prueba de -50 mV a -60 mV. Esta configuración es estándar en los amplificadores de abrazadera de parche. Los pulsos de prueba revelarán un gran transitorio capacitativo que representa la corriente necesaria para cargar la pipeta de parche. Elimine los transitorios capacitivos ajustando las perillas de compensación de capacidad en el amplificador AM 2400 o similar.
6. Aplique pulsos breves de presión negativa para romper la membrana celular y obtener la configuración de la célula completa.
   nota: Se observa una configuración de célula completa cuando hay un gran aumento en los transitorios capacitativos que muestran la capacitancia de la neurona. También es probable que se observe un pequeño aumento en la corriente de retención (línea de base). Configure el amplificador en el modo de pinza de corriente y ajuste el potencial de la celda a -50 a -60 mV.

>5. Probar la conectividad sináptica

1. Configure el sistema de adquisición de datos (DAQ) para activar un controlador de diodo emisor de luz (LED) para generar pulsos de luz. Aquí, se utiliza un sistema DAQ de National Instruments con Matlab para entregar una señal analógica a un controlador LED. La intensidad del LED se ajusta a través de la señal analógica al conductor. El LED es un LED de longitud de onda de 620-630 nm.
2. Coloque el LED rojo de alta potencia directamente debajo de la preparación. Ajusta la intensidad de la luz para que 0,238 mW/^mm2 llegue a la mosca.
3. Activa las neuronas presinápticas mientras grabas desde la célula postsináptica de interés. Lograr la activación celular optogenética, farmacogenaria o mediante estimulación nerviosa. Aquí, se aplican csChrimson y breves pulsos de luz roja.
   NOTA: Las conexiones sinápticas se pueden monitorear en la pinza amperimétrica como potenciales postsinápticos excitatorios (EPSP) o en la pinza amperimétrica como corrientes postsinápticas excitatorias (EPSC). Una conexión sináptica debe ser visible antes de aplicar TTX en respuesta a un pulso de luz de 40 ms. Si no se observa ninguna conexión, es poco probable que las neuronas estén conectadas sinápticamente, ya sea monosinápticamente o polisinápticamente. El potencial de retención se puede ajustar para enfatizar las conexiones excitadoras o inhibitorias en consecuencia.
4. Si se observa una conexión en solución salina normal, agregue TTX al sistema de perfusión para lograr una concentración final de 1 μM. Use una bomba de recirculación para capturar y reutilizar la solución salina para conservar TTX. La bomba peristáltica extraerá la solución salina del baño y la devolverá al depósito de solución salina.
5. Ajuste la velocidad de la bomba para proporcionar un vacío fuerte y constante que no permita que el nivel de solución salina en el baño suba y baje.
   nota: La aplicación de TTX debería resultar en el cese de la actividad de picos en la neurona que está siendo monitoreada en la célula entera. Esto confirma que se ha añadido suficiente TTX a la solución salina.
6. Aplique breves pulsos de luz roja (40 ms por cada pulso) nuevamente. En este punto, cualquier conexión sináptica que quede es probablemente monosináptica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
UAS-csChrimson	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	55135	Se utiliza como activador neuronal
UAS-NaChBac	Centro de Acciones de Drosophila de Bloomington	9466	Restaura la excitabilidad en las células en TTX
Tetrodotoxina	Tochris	Año 1078	Es posible que se necesite un permiso especial para comprar TTX, ya que es una sustancia controlada
todo trans-Retinal	Sigma-Aldrichall trans-Retinal	R2500	Requiere cofactor para la canalrodopsina
Lámina de acero inoxidable 321 soldable, 0.002" de espesor, 10" de ancho	McMaster Carr	3254K7	Se utiliza para hacer un soporte para moscas personalizado. La lámina personalizada se puede cortar con láser a pololu.com del archivo PDF proporcionado
Microscopio de disección	Zeiss	Stemi 2000-C	Se utiliza para la disección de la preparación
Waxer	Almore	Cera Eectra 66000	Se utiliza durante la disección para asegurar la mosca en el papel de aluminio
parafina	Joann	4917217	Se utiliza con cera
Pinzas número 5	Herramientas de Bellas Ciencias	#5CO	Se utiliza para la disección y el desenvainado
Tijeras de disección	Herramientas de Bellas Ciencias	15001-08	Se utiliza para extirpar partes de la cutícula durante la disección
Alambre de tungsteno	Sistemas A-M	797500	Úselo con electrólisis para hacer agujas afiladas para la disección
Bomba peristáltica alternativa	Simply Pumps (Amazon)	PM200S	para recirculación TTX
Controlador de velocidad para bomba peristáltica	Zitrades (Amazonas)	N/A	Controlador de atenuación PWM para luces LED o cinta, 12 voltios 8 amperios, controlador de atenuación de interruptor de luz de brillo ajustable DC12V 8A 96W para tira de luz LED B
Regulador de aire comprimido de precisión Versa-Mount	McMaster Carr	1804T1	Para aplicar presión positiva durante el parcheo
Capilares de vidrio	Instrumentos de precisión mundial	TW150F-3	Para pipetas de parche
Medidor multipropósito	McMaster Carr	3846K431	Manómetro para regulador de presión
Cámara de electrofisiología	Dage MTI	IR-1000	Cualquier cámara que funcione en el rango IR (850 nm) funcionará. No desea utilizar la iluminación roja, ya que puede activar csChrimson
LED IR	Thorlabs	M850F2	Para iluminación oblicua
Fibra óptica para LED IR	Thorlabs	M89L01	Se acopla a LED IR
Lente del objetivo	Olimpo 40X	LUMPlanFLN	Esto se puede usar en la mayoría de los microscipes y funciona bien para visualizar neuronas de mosca.
LED ámbar	Thorlabs	M590L3d	Para visualizar RFP y mCherry
LED azul	Thorlabs	M470L3d	Para visualizar GFP
Juego de filtros GFP	Chroma	49011	Para visualizar la GFP o estimular el canal2rodopsina
Juego de filtros mCherry personalizado	Chroma	ET580/25X y T600LPXR (del conjunto 49306) pero con una óptica de barrera/emisión ET610LP	Úselo solo si desea parchear las neuronas identificadas con channel2rhodopsin
Dicroico para combinar LED ámbar y azul	Thorlabs	DMLP550R	Use solo el parche debajo de mCherry y excite channel2rhodopsin con luz azul.
LED rojo	LEDSupply	Cree XPE 620 - 630 nm	Se utiliza para conducir csChrimson
Controlador LED	LEDSupply	3021-D-E-1000	Se utiliza para impulsar los LED para la estimulación optogenética
manipulador	Instrumentos Sutter	MP-225	Se utiliza para colocar la pipeta durante las grabaciones
Amplificador Patchclamp	Sistemas A-M	Modelo 2400	Un amplificador equivalente es adecuado
Filtro Bessel	Instrumentos Warner	LPF 202A	Filtro auxiliar utilizado para filtrar la traza de corriente al osciloscopio durante la aplicación de parches.
Sistema de adquisición de datos	Instrumentos Nacionales	NI PCIe-6321 781044-01	Se utiliza para registrar datos del amplificador a la computadora
Bloque de conectores - Terminal BNC BNC-2090A	Instrumentos Nacionales	779556-01	Se utiliza para conectar el amplificador a la tarjeta DAQ.
Lámina de acero	McMaster Carr	3254K7	Lámina de acero para cámara de grabación personalizada
Imanes	K&J Magnetismo	D42	Para asegurar la cámara de grabación al soporte del anillo
1/16" Acrílico fundido celular transparente	Pololu		Se utiliza para hacer una cámara de grabación personalizada. El acrílico se puede cortar con láser a pololu.com del archivo PDF proporcionado