Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Fabricación de los electrodos de estimulación
- Para hacer un electrodo de estimulación, corte seis piezas de 10 cm de largo de cables de conexión en miniatura, retire 2 cm del revestimiento en un extremo y 1 cm en el otro extremo.
- Retuerce dos cables juntos y suéldalos por el lado pelado más corto.
- Adquiera una tira de empaquetado de tres cintas de cualquier circuito integrado con la caja SOT-353 (Small Outline Transistor-353).
- Cose los alambres retorcidos a través de los tres agujeros del paquete. El segmento más largo y pelado de los alambres debe estar en las cavidades del paquete. Coloque los cables de modo que el extremo del aislamiento esté alineado con el borde de los orificios.
- Coloque el cemento dental en los agujeros para fijar los cables.
cautela: El cemento dental debe ser lo suficientemente denso para evitar fugas en la cavidad del paquete.
- Una vez que el cemento esté solidificado (mínimo 10 min), voltee el paquete y coloque una capa delgada de superpegamento en el agujero para formar un sello hermético hacia el cemento poroso. Evite pegar los cables pelados.
- Retuerza los cables juntos en el lado más corto y pelado y suéldelos (Figura 1A).
- Agarre el segmento más largo pelado de los alambres con la punta de unas pinzas finas, gírelos y envuélvalos en las cavidades (Figura 1B). Si es necesario, corte el cable sobrante.
>2. Fabricación de los electrodos de registro
- Para hacer un electrodo triplete de registro (Figura 1C-D), corte un trozo de tubo de acero inoxidable de un centímetro de largo con una sierra rotativa de alta velocidad. Retire la aleta de los extremos del tubo con una aguja afilada y asegúrese de que el tubo esté limpio de residuos y completamente permeable.
nota: No use alicates, ya que distorsionarán el tubo.
- Doble un pasador espaciador de tablero chapado en oro con una longitud mínima de 3 cm para formar un soporte en forma de J. Corta la pata más larga de la forma de 'J' y suéldala para recuperar la forma original y hacer una unión desmontable entre la parte lineal larga, que será sostenida por el dispositivo estereotáxico, y la forma de 'U', que sostendrá el electrodo, y servirá como punto de anclaje. Pega el tubo y la pata más corta del soporte en 'J'. Pega algunas barras adicionales de 1 cm de largo, si es necesario, para mayor estabilidad.
- Corta 3 trozos de alambre de electrodo de 2,5 cm de largo con unas tijeras ultrafinas de acero inoxidable. Asegúrese de que el corte sea claro y nítido y que el aislamiento esté intacto en la superficie circular del cable del electrodo. Además, asegúrese de que la punta de corte no esté doblada debido a la fuerza aplicada. Doble 1 o 2 mm en un extremo de cada uno de los cables en diferentes ángulos (por ejemplo, uno recto a la izquierda, uno de 45° y otro recto) para que se distingan.
- Llene el tubo con los alambres. Elija un espaciado adecuado de los electrodos para el experimento (por ejemplo, para el registro del potencial de campo local cortical (LFP) y la densidad de la fuente de corriente (CSD), la protuberancia recomendada de las puntas de los cables desde la abertura del tubo es de 4,5 mm, 4,1 mm y 3,7 mm, respectivamente). Tenga en cuenta qué cable corresponde a qué profundidad para mantener un orden de canal adecuado.
- Una vez que los cables se alineen uno al lado del otro y estén paralelos al tubo, para fijar los cables de los electrodos, coloque una sola gota de superpegamento líquido en ambos extremos del tubo con una aguja afilada. Asegúrese de que el pegamento fluya hacia el tubo debido al efecto capilar, pero no hacia los sitios de grabación en los extremos que sobresalen.
- Prepare una tarjeta de interfaz de electrodo con un microconector adecuado compatible con el sistema de registro que se va a utilizar.
- Introduzca los extremos doblados de los cables que no son de grabación en los orificios de la placa de interfaz de electrodos correspondientes al canal de grabación deseado. Cuando todos los cables estén en su posición, empuje los alfileres de oro en los agujeros con pinzas.
nota: Los clavos de oro se pueden fijar en su lugar con cemento dental, pero en la mayoría de los casos, son lo suficientemente estables sin este paso de seguridad.
>3. Anestesia
- Coloque al animal en una cámara de inducción de anestesia sellada y llénela con 4 - 5% de isoflurano en 2 L/min de aire medicinal.
- Cuando la rata esté recostada, retire al animal de la cámara y colóquelo en un marco estereotáxico con una boquilla de ventilación adecuada.
- Ajuste el nivel de isoflurano al 2%, aunque la tasa de flujo de aire debe permanecer igual. Revise el nivel de anestesia. Si hay una ausencia del reflejo de retirada de la pata en respuesta al pellizco, continúe, de lo contrario, aumente la profundidad de la anestesia.
- Controle y mantenga la temperatura corporal de la rata a 37 ± 0,5 °C con un sistema de monitoreo homeotérmico. Aplique una gotita de ungüento de parafina en los ojos para prevenir la desecación de la córnea. Repita este procedimiento varias veces durante la cirugía, si es necesario.
- Por vía subcutánea, inyectar 0,3 mg/kg de atropina para evitar la formación de moco en las vías respiratorias. Para cirugías más largas, repita esto cada cuatro horas. Controla la respiración y ajusta el vaporizador, si es necesario.
>4. Implantación de los electrodos de estimulación y registro
NOTA: Esterilizar en autoclave todos los instrumentos quirúrgicos necesarios y seguir cuidadosamente las reglas generales de asepsia y antisepsia durante todo el procedimiento. Evite tocar áreas no estériles fuera del área quirúrgica. Sumerja los electrodos en alcohol etílico (70%) durante 30 minutos antes de la implantación.
- Retira la mayor parte del cabello del cuero cabelludo con una cortadora de pelo. Aplique la crema depilatoria en el cuero cabelludo, extiéndala uniformemente sobre la superficie y espere unos minutos. Use una espátula para quitar suavemente la crema y el cabello restante. Enjuague la piel con agua y luego con desinfectante.
- Inyectar lidocaína al 1 - 2% (no superar una dosis total de 7 mg/kg) por vía subcutánea para adormecer la piel. Aplique una sola gota de ungüento veterinario para los ojos (por ejemplo, parafina).
- Haga una incisión sagital completa y larga (~2 cm) en la línea media con un bisturí desde la frente hasta el cuello. Diseccionar los tejidos, incluido el periostio, del cráneo. Luego, con un cincel o pinzas de dientes, limpie el área entre las crestas de los dos huesos temporales. Retrae la piel diseccionada con cuatro bulldogs para mantener el cráneo expuesto.
- Coloque suavemente pinzas finas entre el borde empinado del hueso temporal y los músculos y sepárelos. Realice movimientos de jigging para exponer la mayor superficie posible del hueso temporal, preferiblemente desde el borde del hueso occipital hasta el plano de las suturas coronales, sin dañar los músculos.
- Coloque retractores bitemporalmente para mantener los huesos temporales expuestos.
- Enjuague la superficie del cráneo con 1 - 2 mL de peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2), luego lávelo con 1 - 2 mL de agua.
- Seque al aire la superficie de los huesos temporales con mucho cuidado, limpiando la humedad con palitos oculares. Pruebe si los electrodos de estimulación encajan en la superficie vertical limpia del cráneo (el borde superior del electrodo de estimulación debe estar alineado con el borde de la cresta del hueso temporal). Si es necesario, reajuste los bulldogs y los retractores o dé forma a los electrodos de estimulación con unas tijeras.
- Rellene las cavidades de los electrodos de estimulación con gel electroconductor y coloque una fina capa de pegamento en el borde de los electrodos.
- Coloque el electrodo de estimulación sobre la superficie seca del hueso temporal con un movimiento preciso y manténgalo firmemente en su lugar durante un minuto con pinzas finas. Asegúrese de que no haya humedad en contacto con el pegamento. Limpie con palitos oculares, si es necesario.
cautela: Si el electrodo se vuelve inestable, retírelo. Después de limpiar el hueso, repita este paso con un nuevo electrodo de estimulación.
- Coloque cemento dental sobre los bordes del electrodo de estimulación, secando continuamente la humedad que se filtra en los tejidos con punciones oculares. A continuación, cubra todo el electrodo de estimulación con cemento.
- Después de que el cemento esté completamente endurecido, repita estos pasos en el lado contralateral.
- Taladra algunos agujeros en todo el cráneo para anclar los tornillos. Introduzca tornillos en miniatura en los agujeros y coloque cemento dental sobre ellos. Utilice una cabeza de perforación de diámetro ~ 10% más pequeña en comparación con el diámetro del tornillo.
- Dependiendo del propósito de los experimentos, se suelde un conector a los extremos de los cables, se coloca en la superficie y se cubre con cemento, o se continúa implantando los electrodos de registro y las fibras ópticas, o se prepara una ventana craneal sobre el cráneo. En este último caso, suelde los conectores y fíjelos a la construcción solo al final. En caso de necesidad de registros simultáneos de TES y LFP a largo plazo, implante los tripletes de electrodos antes mencionados en lugar de cables individuales.
nota: Esta configuración permite la eliminación de artefactos de estimulación de modo común8. Para obtener más información sobre el registro de la implantación de electrodos, consulte los protocolos anteriores.
- Lave abundantemente los pañuelos expuestos con desinfectante. Inyectar lidocaína al 1 - 2% por vía subcutánea (no superar una dosis total de 7 mg/kg).
- Desbride los bordes de la herida y ciérrelos con suturas interrumpidas simples alrededor del conector/implante. A continuación, desinfecta la herida con povidona yodada.
- Inyectar 5 mg/kg de carprofeno por vía subcutánea. Repita esto si es necesario.
nota: Se puede utilizar cualquier otro analgésico, que cumpla con los requisitos establecidos por la junta de permisos éticos local.
- Suspender la anestesia, soltar los orejeros y el revólver, y colocar al animal en una jaula de recuperación postoperatoria para recuperar la conciencia.
- Asegúrese de que el animal esté bajo estrecha supervisión durante las primeras horas postoperatorias. Continúe monitoreando el área del implante periódicamente.
nota: El animal no debe dejarse desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Aloje al animal individualmente hasta que se recupere por completo del procedimiento.
