1. Fabricación de electrodos de registro
- Tirando de los electrodos de vidrio
- Utilice el siguiente protocolo para el extractor de microelectrodos (consulte la tabla de materiales):
- Línea 1: Calor 510 Tirón - Velocidad 30 Tiempo 250; Línea 2: Heat 490 Pull - Velocidad 30 Time 250.
nota: Las unidades de tiempo corresponden a 0,5 ms por unidad; Las otras unidades son relativas. El valor del calor debe ajustarse para cada filamento después de realizar la prueba de rampa.
- Utilice un microscopio (aumento de 35x) para asegurarse de que el diámetro interior del electrodo extraído esté en el rango de 7 a 10 μm (Figura 1A). Almacene los capilares en recipientes herméticamente cerrados para evitar la acumulación de polvo.
- Pulido al fuego
- Pulir al fuego los capilares (80 - 90% del valor calorífico máximo durante 1 - 2 s) utilizando una microforja (ver Tabla de Materiales). Asegúrese de que el diámetro interior final del electrodo pulido sea de 5 μm (Figura 1A).
- Doblado
NOTA: Se realizan dos curvas para colocar el electrodo en la parte superior del músculo bajo un objetivo de gran aumento.
- Utilice el aparato que se muestra en la Figura 1B. Fije el electrodo en el manipulador y coloque la punta sobre el filamento, sin tocarlo.
- Ajuste el valor de calor al 60 - 70% del máximo y presione el pedal de la microforja durante 1 - 2 s (ver Tabla de materiales) para calentar el filamento. Utilice una aguja en forma de L para tirar suavemente hacia abajo de la punta del electrodo (Figura 1B ampliada). Realice la curva aproximadamente a 90o (Figura 1C).
- Sostenga el electrodo sobre la llama de la antorcha con la mano con pinzas y haga la segunda curva a una distancia de 7 a 10 mm de la primera curva y en un ángulo de aproximadamente 120o (Figura 1C).
>2. Pasos preparatorios adicionales
- Prepare una solución similar a la hemolinfa (HL3) (en mM): 70 cloruro de sodio (NaCl), 5 cloruro de potasio (KCl), 20 cloruro de magnesio (MgCl2), 10 hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3), 5 trehalosa, 115 sacarosa, 5 N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido etanosulfónico (HEPES) y 1 mM de cloruro de calcio (CaCl2); ajuste el pH a 7.3 - 7.4. Mantenga la solución en el refrigerador y hágala fresca todas las semanas.
- Haga las pipetas de estimulación de la misma manera que las pipetas de vidrio de grabación, excepto que no es necesario doblarlas.
nota: La preparación de los electrodos de estimulación se describe en detalle en los puntos 28 y 27. El diámetro final después del pulido al fuego debe estar en el rango de 5 a 7 μm.
- Inserte una pipeta de estimulación en un soporte de microelectrodos conectado a una jeringa.
>3. Registros eléctricos de corrientes de unión excitatorias (EJCs)
- grabación
- Coloque la placa de Petri con la preparación en la platina del microscopio (Figura 2). Inserte el electrodo de referencia en el baño.
- Llene el electrodo de registro con solución HL3. Bajo el objetivo 10x (ver Tabla de Materiales), sumerja el electrodo en el baño y colóquelo sobre los músculos 6 y 7 de los segmentos abdominales 2, 3 o 4 usando el micromanipulador (ver Tabla de Materiales) (Figura 3 A.1 y A.2).
- Cambie el objetivo a 60x (consulte Tabla de materiales). Concéntrese en el área de interés utilizando la epifluorescencia o la óptica DIC. Coloque la punta del electrodo en la parte superior del botón sináptico (Figura 3 B.1-3).
- Presione el electrodo muy suavemente sobre el músculo. Una presión excesiva puede dañar la unión neuromuscular (NMJ) o inducir un aumento de la actividad sináptica espontánea. Asegúrese de que la punta del electrodo no esté obstruida, si lo está, reemplácela.
- Encienda el amplificador, la placa A/D y la computadora.
- Elija el modo de pinza de voltaje en el amplificador.
- Inicie el software de adquisición y elija el modo "sin interrupciones".
- Observe la apariencia de corrientes de unión excitatorias en miniatura (mEJC) en la pantalla de la computadora.
- Asegúrese de que la amplitud de los mEJC esté en el rango de 0,2 - 0,7 nA.
nota: Los EJC más pequeños indican que el electrodo de registro tiene defectos o que no está colocado correctamente.
- estimulación
- Con ayuda de un micromanipulador, bajo control visual, coloque el electrodo de estimulación cerca del axón que inerva los segmentos abdominales 2 - 4.
- Aplique presión negativa tirando del pistón de la jeringa conectada al portaelectrodos para que el axón quede dentro del electrodo (Figura 2).
- Enciende el estimulador. Gire la perilla de la unidad de aislamiento (consulte la Tabla de materiales) para establecer una corriente cero y luego auméntela suavemente hasta que aparezcan los EJC (o hasta que se alcance el umbral).
- Realizar la estimulación en un régimen supraumbral, con la corriente de estimulación aumentada aproximadamente dos veces, en comparación con el umbral para la observación de EJCs.
nota: En nuestra experiencia, dicha intensidad de estimulación es óptima para evitar fallas potenciales de acción y disparos potenciales de acción. Por ejemplo, si aparecen EJC con una corriente de estimulación de 0,2 mA, utilice una corriente de 0,4 mA durante todo el experimento.
