$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Configuración del sistema
- Construya la unidad de control de presión.
- Ensamble la unidad de control de presión de acuerdo con el mapa del circuito (Figura 1). Suelde las piezas necesarias en la placa de circuito impreso (PCB) fabricada de acuerdo con los esquemas del circuito eléctrico (Figura 1b). Utilice resistencias estándar, LED (diodos emisores de luz), transistores de efecto de campo (MOSFET) de semiconductores de óxido metálico, condensadores y conectores. Suelde las válvulas solenoides en la PCB (placa de circuito impreso). Conecte la bomba de aire y el sensor de presión de aire a la placa de circuito impreso con un cable eléctrico.
NOTA: Una vez que todas las piezas necesarias estén disponibles, la unidad de control de presión debe construirse en aproximadamente 2 horas.
- Conecte la placa de adquisición de datos secundarios (DAQ).
- Conecte las salidas de datos de la placa de circuito impreso a la placa DAQ, siguiendo la Tabla 1.
nota: La placa DAQ se ejecutará en "modo de un solo extremo". El mapa del puerto se encuentra en el manual del usuario (consulte la Tabla de materiales).
- Conecte "AIn Pr S" a uno de los canales de entrada analógica (AI) y "R-Gr" a una de las tierras analógicas de la placa DAQ secundaria.
- Conecte la salida primaria del amplificador a uno de los canales AI y la tierra a la tierra analógica de la placa DAQ secundaria.
NOTA: Se puede utilizar un cable BNC estándar para conectar la salida primaria del amplificador.
- Pele el otro extremo y conecte la señal positiva (es decir, el núcleo de cobre) al canal AI y la tierra (es decir, el cable delgado alrededor del núcleo) a la tierra analógica. Repita este paso para un segundo canal si se utiliza más de un canal de parche.
NOTA: La entrada analógica a la placa DAQ se configurará en pasos posteriores.
- Conecte la alimentación a la salida de alimentación de la placa DAQ secundaria. Utilice una fuente de alimentación de 12 V separada para la bomba.
- Conecte el tubo.
- Conecte la bomba de aire y las dos válvulas.
- En el último paso, utilice un conector de 3 vías para conectar el tubo blando desde el puerto superior de la válvula 2 al sensor de presión y al soporte de la pipeta.
- Si se utilizan dos pipetas, añada otro conector de 3 vías al tubo conectado al soporte de pipetas. Al parchear, cambie manualmente entre las válvulas y las pipetas en uso.
- Instale Autopatcher IG.
NOTA: Requisito del sistema: Autopatcher IG solo se probó en una PC con Windows 7. No ha sido validado para otros sistemas operativos. El procedimiento descrito se aplica específicamente a los herrajes enumerados en la Tabla de materiales.
- Descargue Autopatcher-IG desde GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
- Instale Python (consulte la Tabla de materiales para conocer la versión y la dirección de descarga).
- Desinstale la biblioteca PyQt4 escribiendo "pip uninstall PyQt4" en un terminal de línea de comandos.
nota: El sistema utiliza una versión anterior de la biblioteca PyQt4 para lograr la compatibilidad con las bibliotecas Qwt y Opencv.
- Instale bibliotecas de Python a partir de archivos históricos de rueda (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Busque los siguientes archivos: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) y Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
- Para instalar los archivos de la rueda, vaya al directorio donde están guardados los archivos y escriba "pip install ***wheelfilename***.whl." Sustituya "***wheelfilename***" por el nombre real del archivo.
NOTA: "cp27" en el nombre del archivo wheel indica Python 2.7 y "win32" indica Windows de 32 bits. Si "win32" no funciona, pruebe con "win64".
- Para controlar la cámara CCD (dispositivo de carga acoplada), descargue e instale el instalador para 64 bits (https://www.qimaging.com/support/software/). A continuación, descargue MicroManager para 64 bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) para controlar la cámara en Python.
- Para controlar los manipuladores y la platina del microscopio, instale el software de control proporcionado por el fabricante.
nota: Al hacer esto, también se instala el controlador necesario para controlar los manipuladores. El paquete de instalación se proporciona comúnmente en un CD-ROM.
- Para controlar la placa DAQ secundaria, instale la Biblioteca Universal desde el CD-ROM, suministrada con la compra de la placa DAQ.
- Configure el hardware para Autopatcher IG.
- Conecte la platina del microscopio y los controladores del manipulador a la computadora a través de los puertos USB.
- Asigne los números de puerto COM a la unidad 0: platina del microscopio, a la unidad 1: manipulador izquierdo y a la unidad 2: manipulador derecho, en este orden, en el archivo de configuración "ports.csv" de la carpeta "configuración". Deje los demás parámetros en el archivo ports.csv (es decir, "SCI" y "1") sin cambios.
nota: La información del número de puerto COM se puede encontrar ejecutando el software de configuración del manipulador proporcionado por el fabricante. Vaya a la pestaña "configuración", seleccione "configuración" y la página "Movimiento", y lea las etiquetas de cada pestaña en la parte superior. Alternativamente, esta información se puede encontrar en el Administrador de dispositivos de PC.
- Asigne números de canal de entrada analógica en la placa DAQ para un sensor de presión y los canales de conexión 1 y 2 (correspondientes a las unidades 1 y 2). Introduzca el número de canal en el archivo "DAQchannels.csv" en la carpeta "configuración".
nota: Se recomienda abrir los archivos .csv con la aplicación Bloc de notas en lugar de una hoja de cálculo, ya que puede alterar la información al guardar los cambios.
- Ejecute Autopatcher IG.
- Encienda el amplificador, el controlador del microscopio y el controlador del manipulador. Asegúrese de que el software del amplificador se esté ejecutando.
- Ejecute Autopatcher IG con Python desde un terminal de línea de comandos de la siguiente manera: primero, cambie el directorio (comando "cd" para los terminales más comunes) donde está instalado Autopatcher IG, escriba "python Autopatcher_IG.pyw" en el terminal de línea de comandos y presione la tecla "Enter><".
NOTA: No ejecute el software de control del manipulador antes de ejecutar Autopatcher IG porque ocupará la etapa del microscopio y el manipulador, lo que hará que Autopatcher IG no pueda encontrar el hardware. El software de control del manipulador se puede ejecutar después de que Autopatcher IG se haya iniciado por completo si hay módulos adicionales para controlar (por ejemplo, el calentador en línea).
- Calibrar la pipeta primaria.
- Tire de las pipetas de parche. Llene una pipeta de vidrio estirado con una solución interna y cárguela en la platina principal.
NOTA: Las pipetas de vidrio vacías tienen diferentes contrastes bajo el microscopio y pueden dar lugar a una calibración inexacta.
- Mueva la punta de la pipeta al campo visual del microscopio y enfóquela. Si se utiliza el teclado de marcación para mover los manipuladores y/o la platina del microscopio, actualice las coordenadas pulsando "z" en el teclado.
nota: Esta acción no es necesaria si el teclado (platina del microscopio: A/D - eje x, W/S - eje y, R/F - eje z; manipuladores: H/K - eje x, U/J - eje y, O/L - eje z, 1/2 - número de unidad) para controlar el movimiento porque las coordenadas se actualizarán en tiempo real.
- Haga clic en el botón "Iniciar calibración" en la interfaz gráfica de usuario (GUI) principal de la unidad correspondiente en la que se carga la pipeta (Figura 2).
nota: Aparecerá una ventana emergente cuando finalice la calibración.
NOTA: La calibración se llevará a cabo automáticamente, lo que tardará unos 3,5 minutos. Al hacer clic en el mismo botón (cambiado ahora a "cancelar calibración" después de iniciar la calibración) se abortará el intento de calibración.
- Guarde la calibración haciendo clic en "guardar calibración" en la parte inferior de la GUI principal (guarda la calibración actual para ambos manipuladores y se puede cargar en el futuro).
NOTA: El campo de visión con aumento bajo (4 o 10X) y alto (40X) debe estar alineado para que la calibración secundaria funcione correctamente. Consulte el manual de usuario del sistema óptico en uso para conocer los procedimientos de alineación.
>2. Procedimiento automático de fijación de parches
- Preparar cortes de cerebro agudos
- Prepare pipetas de vidrio para la pinza de parche.
- Coloque un trozo de cerebro en el centro de la cámara de grabación. Estabilice la rebanada con una rebanada o "arpa".
- Detecta la célula fluorescente.
- Encuentre el área de interés debajo de la lente 4X. Mueva la platina del microscopio activando el modo de clic para mover ("CTM") y haciendo clic en el centro del área de interés. Alternativamente, utilice el teclado para mover la platina del microscopio (A/D - eje x, W/S - eje y, R/F - eje z).
- Cambie a la lente de gran aumento y ajuste el enfoque moviendo el microscopio en el eje z, usando R/F en el teclado.
NOTA: Se recomienda ajustar el nivel del baño de agua para que el plano focal debajo de las lentes de bajo y alto aumento sea el mismo o similar en el eje z.
- Haga clic en el botón "Detectar celda" en la columna principal de la GUI, "Unidad 0". Si la fuente de luz LED o láser de la configuración no puede ser controlada por la señal TTL, encienda manualmente el LED / láser; aparecerá una ventana emergente cuando finalice la detección de celda.
- Apague el LED/láser si es necesario; aparecerá una lista de coordenadas de celda en la GUI "Posiciones de memoria". Elimine las celdas no deseadas de la lista haciendo clic en el botón "X" junto a las coordenadas.
- Alternativamente, si las celdas objetivo no están marcadas con fluorescencia, haga clic en "Modo de ratón" en la GUI principal. Haga clic en la celda de interés; aparecerá un punto amarillo con un número en la celda, y las coordenadas de la celda aparecerán en la GUI "Posiciones de memoria".
- Calibrar la pipeta secundaria.
- Llene 1/3 de una pipeta de vidrio con solución interna. Cargue la pipeta en el soporte de pipetas instalado en la platina principal.
- Utilice la lente de bajo aumento. Lleve la pipeta al campo visual y ajuste el enfoque con el teclado (H/K - eje x, U/J - eje y, O/L - eje z). Utilice "1" y "2" para cambiar entre la unidad 1 y la unidad 2.
- Cargue la calibración primaria haciendo clic en "Cargar calibración". Haga clic en el botón "Calibración secundaria" en la GUI principal debajo de la unidad que está en uso. Por ejemplo, si la unidad 2 está en uso, haga clic en el botón "Calibración secundaria" en la columna "Unidad 2". Siga las instrucciones de la ventana emergente para cambiar a la lente de gran aumento.
- Parchear una celda objetivo.
- Asegúrese de que el software "MultiClamp" (es decir, el amplificador) se esté ejecutando. Haga clic en el botón "Control de parches" para abrir la GUI de "Control de parches"; puede tardar unos minutos en abrir esta GUI.
- Utilice la lente de aumento de 40X marcando "40X" en la columna principal de la GUI "Unidad 0". Haga clic en el botón "ir a" junto a la celda de interés en la lista de coordenadas en la GUI "Posición de memoria"; El microscopio se moverá a la célula.
- Haga clic en el botón CTM de la unidad en uso en la GUI principal para habilitar el movimiento después de un clic del mouse. Haga clic en la celda de interés; La punta de la pipeta se moverá a la célula.
- Haga clic en el botón "Parche" en la GUI "Control de parches".
nota: Comenzará la aplicación automática de parches y la presión y la resistencia se pueden monitorear en la GUI de "Control de parches".
- Utilice el botón "Unidad 1 seleccionada" para cambiar la señal de entrada entre las dos unidades.
NOTA: El sistema se acercará a la celda objetivo, aplicará presión negativa, coincidirá con el potencial de la membrana celular y detectará la formación de gigasellos en función de una serie de umbrales y lógica de presión y resistencia.
- Manipule el proceso automático en cualquier momento haciendo clic en los botones respectivos en la GUI de "Control de parches". Por ejemplo, haga clic en el botón "Parche" nuevamente para cancelar la prueba del parche y haga clic en "Siguiente etapa" para avanzar el proceso de parcheo al siguiente paso, independientemente del umbral.
NOTA: Una ventana emergente notificará al usuario cuando se haya formado un gigaseal, y se presentará la opción de aplicar zap junto con una gran presión negativa.
- Seleccione "Sí" para entrar con zap y succión combinadas. Alternativamente, seleccione "No" para entrar solo con succión.
NOTA: Cuando se completa con éxito un parche de celda completa, una ventana emergente le recordará al usuario que guarde el registro de parches del experimento.
- Guarde el registro de parches del experimento.
NOTA: Si una prueba de parches no se realiza correctamente, una ventana emergente notificará al usuario y el proceso de parches se reiniciará.
- Vuelva al paso 2.4 y repita los pasos con una celda diferente.