Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de solución de perfusión y compuestos de prueba
- Prepare 5 L de solución Krebs: 113 mM de cloruro de sodio, NaCl, 5,9 mM de cloruro de potasio, KCl, 1,2 mM de fosfato de sodio dihidrógeno, NaH2PO4, 1,2 mM de sulfato de magnesio, MgSO4, bicarbonato de sodio 25 mM, NaHCO3, 1,2 mM de cloruro de calcio, CaCl2 y 11,5 mM de glucosa. Sature la solución con una mezcla de gases 95% O2 + 5% CO2. Pre-enfriar ~500 mL de Krebs oxigenados en la nevera.
- Prepare alícuotas de compuestos de prueba (1 mM de capsaicina en etanol y 10 mM de 5-hidroxitriptamina (5-HT) en solución salina) según sea necesario. Diluir el caldo en Krebs (para aplicación en baño) y en solución salina (para administración intraluminal) hasta la concentración final justo antes de su uso.
>2. Preparación del electrodo registrador
- Extraiga el electrodo de registro de tubos de vidrio estándar sin filamentos internos (diámetro exterior de 1,5 mm) utilizando un extractor de electrodos convencional. Ajuste la configuración del extractor para el calor y la tracción de modo que el vástago de los electrodos extraídos esté entre 20 y 25 mm.
>3. Recolección de tejidos
- Anestesiar profundamente a la rata con pentobarbital sódico (80 mg/kg, i.p.).
- Al mismo tiempo que garantiza la esterilidad, exponga la cavidad abdominal realizando una incisión en la línea media de la pared abdominal con un bisturí. Aparta el mesenterio y otros tejidos para exponer el colorrectal.
- Coloque al animal bajo el microscopio de disección. A través de una disección cuidadosa, localice el ganglio pélvico izquierdo (PG) e identifique los nervios pélvicos (PN) y los nervios esplácnicos lumbares (LSN) que lo unen. Corta estos nervios a unos milímetros de distancia del PG.
nota: El PG se encuentra cerca de la unión colorrectal. Típicamente, 3 - 4 NP desde la médula espinal lumbosacra y un proyecto de LSN hasta el PG (Figura 1).
- Corta el hueso de la sínfisis para exponer el recto. Extirpar los tejidos (es decir, la vejiga urinaria, etc.) por encima del colorrectal; tenga cuidado de dejar el PG intacto.
- Sacrificar a la rata mediante la inyección intravenosa de una sobredosis de pentobarbital. Transecte el colon a unos 3 cm por encima del PG y retire el colorrecto del animal con pinzas.
- Transfiera el colorrecto a una placa de Petri llena de solución Krebs preenfriada. Retire las heces enjuagando suavemente el colon. Retire la vejiga urinaria remanente y otros tejidos con cuidado, sin comprometer el PG.
>4. Disección de los nervios aferentes del colon
- Coloque el colon en una cámara de registro (20 mL) y perfunda el tejido continuamente con una solución de Krebs carbogenada. Ajuste la velocidad de perfusión a 15 mL/min.
- Cánula el colorrecto tanto en el extremo oral como en el anal. Iniciar la infusión intraluminal del colon con solución salina a razón de 10 mL/h en el sentido oral a anal.
- Localiza el PG principal bajo el microscopio de disección. Usa alfileres para insectos para exponer el ganglio. Con una disección cuidadosa, encuentre una rama fina de nervio que emane del ganglio y corra hacia el colon (Figura 1). Corta el nervio cerca del ganglio.
NOTA: La figura 1 ilustra un registro de una rama nerviosa distal a la PG. Presumiblemente, el nervio contiene una mezcla de fibras aferentes esplácnicas pélvicas y lumbares. Alternativamente, se puede realizar una grabación desde el PN y/o el LSN proximal al PG.
- Encienda el baño calefactor y caliente la solución Krebs para mantener la temperatura de la cámara entre 34 ± 0,5 °C.
>5. Preparación del electrodo de succión
- Tome una pipeta de vidrio preextraída (paso 2) e inspecciónela bajo el microscopio de disección. Romper la punta del electrodo con un par de pinzas para que tenga un tamaño compatible con el diámetro del nervio que se va a registrar.
- Biselar la punta colocándola cerca de un destello más ligero.
>6. Registro electrofisiológico
- Conecte el electrodo biselado al portaelectrodos. Conecte una jeringa de 10 ml al puerto lateral del soporte para aplicar presión negativa o positiva al electrodo.
- Conecte el soporte a la cabecera del bioamplificador y monte la cabecera en un manipulador.
- Mueva el electrodo al baño de tejido y llene el electrodo con la solución de Krebs aplicando una succión suave hasta que entre en contacto con el alambre de plata del soporte. Coloque la punta del electrodo cerca del extremo cortado del nervio y aplique presión negativa para succionar el nervio dentro del electrodo. Aplique más presión negativa para que ~ 1 mm del nervio se introduzca en el electrodo y forme un sello hermético.
- Encienda el bioamplificador y ajuste el filtro a 300 - 3.000 Hz. Monitoree la señal en el osciloscopio y registre la señal nerviosa (frecuencia de muestreo de 20 kHz) y la señal de presión intraluminal (frecuencia de muestreo de 100 Hz) utilizando una computadora con software de procesamiento de datos de picos.
>7. Probando la sensibilidad aferente colónica
- Aplique la distensión en rampa del colon cerrando el grifo de tres vías en la cánula de salida mientras se infunde continuamente por vía intraluminal. Controle la presión intraluminal hasta que alcance los 60 mmHg, momento en el que abra el grifo de tres vías de la cánula de drenaje.
