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>1. Siembra y trate células endoteliales vasculares cerebrales (CVE) en placas de cultivo celular
- Siembra de células CVE (células bEnd.3) en una placa de cultivo de células de flujo extracelular de 96 pocillos: 80 μL/pocillo. Coloque la placa de cultivo celular a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%. Nota: 16 × 103 celdas por pozo alcanzarán un 60 - 80% de confluencia en 24 h.
- Si las células están expuestas a un producto químico, agregue los tratamientos una vez que las células estén unidas al fondo de la placa (8 a 24 horas después de la siembra).
nota: Para los experimentos de transfección, no agregue antibióticos en un medio de crecimiento completo.
>2. Evaluación de la función mitocondrial mediante el bioanalizador
- Antes del inicio del ensayo, hidratar un cartucho de sensor de flujo extracelular con calibrante añadiendo 150 μL de solución de calibrante de flujo extracelular a la placa e incubar durante la noche a 37 °C sin CO2.
- Usando la estación de lavado de placas, cambie el medio de cultivo celular a un medio de ensayo de flujo extracelular de pH 7.0. Incubar las células a 37 °C sin CO2 durante 30 - 60 min.
- Prepare soluciones de trabajo de 8 μM de oligomicina, 4,5 μM de carbonilcianuro 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP), 10 μM de rotenona y 10 μM de antimicina A en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM). Cargue 25 μL de las soluciones madre en los puertos de inyección del cartucho: Puerto A, oligomicina; Puerto B, FCCP; Puerto C, rotenona y antimicina A con medio de ensayo de flujo extracelular. Implemente el protocolo de ensayo como se describe en la Tabla 1.
- Cargue el cartucho hidratado en el bioanalizador y realice la calibración haciendo clic en el botón "Inicio". Una vez completada la calibración, retire la placa inferior del cartucho y cargue la placa de la celda haciendo clic en el mensaje "Descargar cartucho". Continúe el ensayo hasta que se completen todas las mediciones.
- Abra el archivo de datos y obtenga los valores de velocidad del bioanalizador. Exporte los datos a un archivo de hoja de cálculo.
Tabla 1. El protocolo de ejecución del instrumento.
