Registro de la actividad del nervio aferente mesentérico en un segmento de yeyuno de ratón ex vivo

Resumen

Fuente: Nullens, S., et al. Registro in vitro de la actividad nerviosa aferente mesentérica en segmentos yeyunal y colónico de ratón. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra el proceso de registro de señales eléctricas de nervios aferentes mesentéricos en un segmento yeyuno de ratón disecado para estudiar los efectos de la presión tisular y los cambios de movimiento en la actividad de los nervios aferentes.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación del nervio aferente yeyunal

1. Realizar la eutanasia de roedores del roedor adolescente o adulto que haya sido aprobada antes del experimento por el Comité de Ética local (por ejemplo, sedación terminal seguida de punción cardíaca, luxación cervical, etc.).
   nota: Utilizamos la luxación cervical para sacrificar a los animales, lo que resultó en experimentos sin la necesidad de anestesia adicional o cuidados postquirúrgicos, ya que los tejidos se procesan in vitro.
   nota: Se ha demostrado que la edad atenúa las funciones mecanosensoriales aferentes mesentéricas, por lo tanto, aconsejamos a los investigadores que se adhieran a un grupo de edad específico durante la duración de un solo experimento.
2. Coloque al animal de laboratorio sacrificado en posición supina y realice una incisión en la línea media abdominal a través de la piel y la capa muscular abdominal con un bisturí, que se extienda desde la apófisis xifoides hasta el hueso púbico.
3. Bañar la cavidad abdominal con solución fría de Krebs para evitar que los tejidos intraabdominales se sequen (composición de Krebs: 120,03 mM de NaCl, 6,22 mM de KCl, 1,57 mM de NaH₂PO₄, 15,43 mM de NaHCO₃, 1,21 mM de MgSO₄, 11,52 mM de D-glucosa y 1,52 mM de CaCl₂).
4. Extirpar rápidamente todo el yeyuno con unas tijeras afiladas extirpando aproximadamente 20 cm del intestino delgado comenzando inmediatamente distalmente de la flexión duodenoyeyunal, teniendo cuidado de no dañar las estructuras circundantes y manteniendo intacto el mesenterio del intestino, que contiene los vasos sanguíneos yeyunales y los nervios aferentes.
   nota: Para la mera disección yeyunal en la cavidad abdominal no es necesario utilizar un microscopio estereoscópico, ya que se puede visualizar fácilmente a simple vista.
5. Coloque el yeyuno extirpado en una solución Krebs helada y manténgala en hielo mientras oxigena continuamente la solución de Krebs con carbógeno (95% O₂, 5% CO₂).
6. Corta el yeyuno con unas tijeras afiladas en bucles de aproximadamente 3 cm de largo. Observe el haz mesentérico que contiene los vasos y el nervio esplácnico en algún lugar cerca del centro del asa respectiva.
7. Enjuague cada segmento con la solución de Krebs utilizando un catéter romo para eliminar el contenido luminal y el quimo, ya que estos contienen enzimas digestivas que acelerarán el deterioro de la muestra de tejido in vitro.
   nota: Tenga cuidado de no dañar la luz del asa durante el lavado, ya que la destrucción de las vellosidades dará lugar a la liberación de mediadores que pueden alterar la actividad del nervio aferente.
8. Identifique el segmento para medir la actividad del nervio aferente (por ejemplo, el primer segmento yeyuno distalmente del ligamento de Treitz o la flexión duodenoyeyunal) y colóquelo en una cámara de registro especialmente diseñada recubierta con una capa de elastómero de silicona.
   nota: El comienzo del yeyuno se define anatómicamente como la parte del intestino delgado donde el ligamento de Treitz cruza el intestino delgado, también llamado flexión duodenoyeyunal.
   nota: Cubra la parte inferior de la cámara de grabación con una fina capa de elastómero de silicona mucho antes del inicio del experimento. Prepare esta capa de elastómero de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
9. Perfundir la cámara constantemente con una solución de Krebs tibia y carbogenada a una velocidad de 10 ml/min y mantener constante la temperatura de Krebs en la cámara de registro a 34 °C.
10. Monte el segmento yeyunal en el baño de órganos de modo que el extremo oral esté conectado al controlador de la jeringa que proporciona flujo luminal y el extremo aboral se conecte al flujo de salida. Estire ligeramente el segmento, pero tenga cuidado de no ejercer una tensión excesiva. Fije ambos extremos firmemente con ligaduras de seda 4/0 a los puertos de entrada y salida.
11. Conecte el controlador de la jeringa al extremo oral y perfunda el segmento yeyunal intraluminalmente con solución de Krebs (no oxigenada, temperatura ambiente) a una velocidad de 10 ml/h.
12. Utilice alfileres de insectos para sujetar el mesenterio del segmento intestinal montado contra la capa inferior de elastómero de silicona. Estire el mesenterio para optimizar la visualización del haz mesentérico; No ejerza presión sobre el haz ni sobre el yeyuno.
13. Realice una prueba de distensión de la rampa (vide infra) cerrando el puerto de salida hasta que la presión intraluminal del segmento intestinal alcance los 60 mmHg para verificar que no haya fugas de solución de Krebs intraluminal del segmento montado. Observe un aumento suave de la presión intraluminal sin interrupciones.
14. Observar pequeñas contracciones del segmento (ondas peristálticas) durante la fase inicial de distensión. Si es necesario, bloquee la actividad peristáltica agregando 1 μM del bloqueador de canales de calcio tipo L nifedipino a la solución de Krebs.
    nota: La adición de 1 μM de atropina a la solución de Krebs además de nifedipino paralizará completamente el segmento intestinal.
15. Bajo un microscopio estereoscópico, comience a despegar suavemente el tejido graso del mesenterio tirando suavemente de él con dos pinzas pequeñas, teniendo cuidado de no dañar los vasos y el nervio aferente que yacen enterrados en el tejido graso.
16. Comience a una distancia remota del yeyuno y exponga ambos vasos sanguíneos en el haz mesentérico.
17. Observe el nervio yeyunal aferente entre ambos vasos como un hilo delgado y blanco encapsulado en tejido adiposo. Solo se disecciona más proximalmente hacia el yeyuno pelando suavemente el tejido graso con pinzas cuando la identificación inicial de ambos vasos mesentéricos y/o el nervio aferente es difícil.
18. Diseccionar el nervio mesentérico yeyunal del segmento libre a una distancia de varios milímetros, eliminando el tejido adiposo adherido al nervio.
19. Transecte el nervio con tijeras de tejido afiladas. Si es necesario, retire la grasa y el tejido conectivo restantes, así como la vaina epineuronal, tirando suavemente de ella con las pinzas pequeñas.
20. Usando un micromanipulador, baje la punta del electrodo de succión, conectado a una jeringa con un émbolo, en el baño de órganos; luego, manipulando el émbolo, aspire suavemente un poco de solución de Krebs del baño de órganos de modo que la punta del electrodo quede sumergida en la solución de Krebs (Figura 1). Asegúrese de que la solución Krebs cubra el electrodo de alambre dentro del electrodo de succión.
    nota: Utilice un extractor de pipetas para preparar el capilar de succión de vidrio de borosilicato que contiene el electrodo de alambre antes de que comience el experimento.
21. Coloque la punta del electrodo de succión inmediatamente al lado de la hebra nerviosa aferente seccionada y tire de la hebra nerviosa seccionada hacia el capilar en toda su longitud.
22. Maniobre la punta del electrodo hacia algún tejido adiposo y aspire este en el capilar de vidrio mientras aspira firmemente con el émbolo, "sellando" así mecánicamente el nervio en el capilar del contenido del baño de órganos.
23. Verifique el registro de la actividad nerviosa aferente utilizando el sistema de adquisición de datos, por ejemplo, realizando un aumento inducido por la distensión en rampa en el disparo aferente (vide infra). Después del aislamiento del nervio en el electrodo de succión, estabilice la preparación durante 15 minutos para obtener un estado estable de actividad nerviosa aferente espontánea antes de realizar los experimentos reales.
24. Para realizar la distensión de la rampa, distienda el segmento intestinal cerrando el puerto de salida, lo que provoca un aumento gradual de la presión (hasta 60 mmHg). Solo realice el protocolo experimental deseado cuando tres distensiones de rampa consecutivas (con un intervalo de 15 minutos) produzcan una descarga multiunidad reproducible (Figura 2).

Resultados

Figura 1: Descripción general esquemática de la cámara de registro especialmente diseñada y el electrodo de succión. Descripción detallada de la configuración técnica con el electrodo de succión y la cámara de registro en su lugar.

Figura 2: Trazado representat...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloruro de sodio (NaCl)	Productos químicos de VWR	2,78,10,295	Solución compuesta de Krebs
Cloruro de potasio (KCl)	Acros orgánicos	196770010	Solución compuesta de Krebs
Dihidrógeno fosfato de sodio (NaH2PO4)	Productos químicos de VWR	1,06,34,61,000	Solución compuesta de Krebs
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Merck	1,06,32,91,000	Solución compuesta de Krebs
Sulfato de magnesio (MgSO4)	Merck	1,05,88,61,000	Solución compuesta de Krebs
Cloruro de calcio (CaCl2)	Merck	2,38,11,000	Solución compuesta de Krebs
D-glucosa	Productos químicos de VWR	1011175P	Solución compuesta de Krebs
agua destilada			Solución compuesta de Krebs
Tubo de PVC	Suministros de laboratorio científico		El segmento intestinal debe montarse sobre un tubo de PVC
Tubo de silicona	Suministros de laboratorio científico		El resto de la tubería, idealmente a base de silicona, desaloja más fácilmente los residuos en la tubería
Hilo de seda	Pearsall Limitada	10B15S220	Fijación del segmento sobre el tubo de PVC
Controlador de jeringas	Aparato de Harvard	55-2222	Infusión intraluminal de Krebs
Prismáticos: incluye aumento de 10x en oculair	Zeiss STEMI 2000		Visualización óptima para la disección del nervio aferente
Unidad de control de manta homeotérmica	Aparato de Harvard	507214	Calentamiento de la cámara del órgano
Bañera de órgano hecha a medida con fondo cubierto de Sylgard
Software Spike2			Registro y análisis de los datos
Pasadores para insectos, 500 piezas, acero inoxidable, diámetro 0,2 mm	Austerlitz insect pins minutiens		Disección del nervio aferente
Pinza Dumont #5 inox 11cm	Instrumento de precisión mundial	500341	Disección del nervio aferente
Tijera, muelle, 14 cm	Instrumento de precisión mundial	Año 15905	Disección del nervio aferente
DB digitimer	NL 108T2/10		transductor de presión
Micromanipulador	Narishige	M-3333	Manipulación 3D del electrodo de aspiración
Micromanipulador	Bloque giratorio X-4		Manipulación 3D del electrodo de aspiración
Micromanipulador	Soporte magnético GJ-8		Manipulación 3D del electrodo de aspiración
Fuente de luz	Microscopios Euromex Holanda EK-1		Visualización óptima para la disección del nervio aferente
Aparato de registro CED 1401			Registro de la actividad nerviosa aferente
Eliminador de ruido Humbug 50/60Hz	Misión Instrumentos Científicos		Eliminación del ruido de fondo
Bomba de infusión	Gibson Minipuls 2		Infusión de la cámara del órgano en la que se monta el segmento
Soporte de microelectrodos de medias celdas de 1,5 mm	Instrumento de precisión mundial	MEH2SW	Electrodo de succión para el aislamiento de la fibra aferente
Capilares de vidrio de borosilicato, 300 uds.; 1.5/0.84 OD/ID	Instrumento de precisión mundial	1B150-4	Capilar para el aislamiento del nervio aferente