Establecimiento de una pinza de parche de celda completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales vomeronasiales

Resumen

Fuente: Ackels, T., et al. Análisis fisiológico en profundidad de poblaciones celulares definidas en cortes de tejido agudo del órgano vomeronasal de ratón. J. Vis. Exp. (2016)

El video del protocolo describe el establecimiento de una pinza de parche de célula completa para el registro electrofisiológico de las neuronas sensoriales del órgano vomeronasal (VNO) en ratones. Un corte coronal de VNO con neuronas sensoriales marcadas con fluorescencia se coloca en una configuración de grabación. Una neurona marcada se conecta con una pipeta de registro en una configuración de celda completa para el registro electrofisiológico en respuesta a estímulos químicos.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparación de la solución

1. Prepare la solución extracelular S₁: 4-(2-hidroxi-etil)piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) solución extracelular tamponada que contiene (en mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 HEPES; pH = 7,3 (ajustado con NaOH); osmolaridad = 300 mOsm (ajustado con glucosa).
2. Prepare la solución extracelular S₂: Solución extracelular oxigenada por carbógenos (95% O₂, 5% CO₂) que contiene (en mM) 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 5 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgSO₄, 5 bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES); pH = 7,3; osmolaridad = 300 mOsm (ajustado con glucosa).
3. Preparar una solución de agarosa a baja temperatura de gelificación al 4% (S₃) para la inclusión en tejidos: 4% de agarosa a baja temperatura de gelificación. Disolver 2 g de agarosa poco gelificante en 50 ml de S₁ en un frasco de laboratorio de vidrio de 100 ml junto con un agitador magnético. Para derretir la agarosa, coloque el frasco en un baño de agua (con la tapa no bien cerrada) a 70 °C durante aproximadamente 20 minutos o hasta que la solución se vuelva transparente mientras se agita. Enfriar y mantener la agarosa derretida en un segundo baño de agua a 42 °C hasta su nuevo uso.
4. Prepare la solución intracelular S₄: Solución de pipeta que contiene (en mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), 0,3 CaCl₂ (Ca²⁺ libre = 110 nM), 10 HEPES, 2 adenosina 5′-trifosfato sal magnésica (MgATP), 1 guanosina 5′-trifosfato sódico sal (NaGTP); pH = 7,1 (ajustado con KOH); osmolaridad = 290 mOsm.
5. Modificar/ajustar la composición de S₁, S₂ y S₄ de acuerdo con el diseño experimental individual (por ejemplo, bloqueadores farmacológicos para aislar ciertos tipos de corrientes activadas por voltaje).

>2. Disección e incrustación de VNO

1. Sacrificar al animal mediante una breve exposición al CO₂ y decapitarlo con tijeras quirúrgicas afiladas. Nota: Dado que el tiempo que transcurre desde el sacrificio del animal hasta la colocación de la cápsula VNO en hielo es crítico, minimice el tiempo a menos de 2 minutos. Para mantener la viabilidad del tejido, incruste ambos VNOs completamente disecados en agarosa en menos de 30 min.
2. Retire la mandíbula inferior con unas tijeras quirúrgicas grandes. Entra por la cavidad bucal y corta los huesos de la mandíbula y el músculo de cada lado por separado.
3. Coloque la parte restante de la cabeza boca abajo en la placa de Petri grande.
4. Retire la piel de la mandíbula superior y alrededor de la punta de la nariz con pinzas medianas para obtener un mejor acceso a los incisivos.
5. Use tijeras para huesos para cortar la parte más grande de los incisivos en un ángulo de ~45 ° en la dirección rostral (Figura 1A). Esto facilitará la extracción de la cápsula de VNO de la cavidad nasal.
   nota: No corte hasta la raíz del diente para evitar daños en la punta de la cápsula de VNO.
6. Agarre el paladar superior rígido en su parte rostral con pinzas medianas y despegue cuidadosamente una pieza en un ángulo plano (Figura 1B).
   nota: Enjuague repetidamente con S₂ helado.
7. Use tijeras de microresorte para cortar la fusión ósea entre la punta del hueso vómer y la mandíbula. Inserte las puntas de las tijeras con la parte curva de la punta apuntando hacia afuera, lejos del VNO, y corte con cuidado el hueso en pequeños pasos tanto en el lado izquierdo como en el derecho, lateral a la cápsula VNO.
8. Para extraer la cápsula de VNO, use unas tijeras de microresorte para cortar el hueso vómer en la parte caudal y levante con cuidado el hueso vómer fuera de la cavidad nasal con pinzas medianas. Transfiera inmediatamente el VNO a una pequeña placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico en una bolsa de gel de hielo donde se realizarán los pasos restantes de la disección.
9. Enjuague el VNO con una pequeña cantidad de S₂ helado para evitar que el tejido se seque.
10. Separe las cápsulas cartilaginosas que contienen los tejidos blandos del VNO agarrando la parte posterior del hueso vómer con pinzas medianas. Coloque la cápsula para una vista dorsal, de modo que se haga visible una división entre ambos VNO (Figura 1D_i).
11. Utilice la punta de las pinzas finas para separar ambas cápsulas de cartílago VNO del hueso central mientras mantiene el hueso vómer inmovilizado en la parte posterior.
    nota: Use pinzas solo en el borde de la cápsula de cartílago y tenga mucho cuidado de no perforar el cartílago, ya que el delicado epitelio sensorial se daña fácilmente.
12. Una vez que los dos VNOs estén separados, comience a extraer el cartílago que encapsula el primer VNO.
13. Agarre el borde superior de la cápsula con una pinza fina y separe la pared del cartílago que estaba previamente unida al hueso del vómer (lado medial).
14. Para eliminar el cartílago restante, gire el VNO con su lado lateral curvo hacia el fondo del plato y sujete firmemente el cartílago de un lado con pinzas. Mueva con cuidado la segunda pinza fina desde la parte posterior en un ángulo muy plano entre el cartílago y el VNO para aflojar la conexión entre el tejido y el cartílago.
15. Retire lentamente el VNO del cartílago sosteniéndolo en su punta caudal, para evitar dañar el epitelio sensorial.
16. Una vez que el VNO se haya apalancado de la cápsula, asegúrese de eliminar todas las partes pequeñas de cartílago restantes, ya que cualquier pieza de cartílago restante desprenderá el tejido de la agarosa circundante durante el proceso de corte.
17. Coloque una pequeña gota de S₂ helada en el primer VNO disecado para evitar daños en los tejidos. Un gran vaso sanguíneo en el lado lateral se hará visible, lo que indica que el órgano aún está intacto y no fue dañado gravemente durante la disección (Figura 2A_ii). En caso de que el vaso sanguíneo se haya dañado, valdrá la pena continuar con el corte del VNO siempre que la morfología general no se haya visto claramente afectada.
18. Disecciona inmediatamente el segundo VNO.
19. Para incrustar los VNO, llene ambas placas de Petri pequeñas hasta el borde con S₃ derretido (almacenado en un baño de agua a 42 °C; ver 1.3).
20. Sostenga el VNO en el extremo caudal más ancho con pinzas finas para evitar daños en el epitelio sensorial.
21. Sumerja el VNO en la agarosa y muévalo horizontalmente hacia adelante y hacia atrás varias veces para eliminar la película de solución extracelular, así como las burbujas de aire de su superficie.
22. Coloque el VNO verticalmente con la punta caudal hacia el fondo del plato. En lugar de pellizcar el VNO directamente con las pinzas, ajuste la orientación moviendo la punta de la pinza muy cerca del VNO.
    nota: La orientación durante la incrustación es crucial, ya que determina el plano de corte y la accesibilidad a las neuronas sensoriales durante el experimento.
23. Coloque los platos en una bolsa de hielo en gel y espere hasta que la agarosa se haya solidificado.
    Nota: No cambie la orientación del VNO una vez que la agarosa haya comenzado a solidificarse, ya que esto desprenderá el tejido de la agarosa circundante.

3. Corte de tejido VNO coronal

1. Use una espátula pequeña para quitar el bloque de agarosa del plato pequeño y colóquelo en la tapa de una placa de Petri grande, voltee la agarosa al revés dejando la punta caudal del VNO hacia arriba.
2. Corta el bloque en forma piramidal con un bisturí quirúrgico (3-4 mm en la punta, 8-10 mm en la parte inferior). Tenga cuidado de no dañar el tejido incrustado.
3. Use superpegamento para fijar el bloque en forma de pirámide al centro de la placa de muestra del vibratomo y espere ~ 1 minuto para que el pegamento se seque por completo.
4. Transfiera la placa de muestra a la cámara de corte y prepare el segundo VNO, en consecuencia. Mantenga la placa con el segundo espécimen a 4 °C hasta su uso.
5. Utilice un micrótomo de cuchilla vibratoria con los siguientes ajustes: grosor: 150-200 μm; velocidad: 3,5 u.a. = 0,15 mm/seg; frecuencia: 7,5 u.a. = 75 Hz. Transfiera las rodajas a la cámara de oxigenación hasta su uso después de inspeccionar brevemente la morfología de las rodajas bajo el microscopio de disección. Las rodajas se pueden conservar durante varias horas.

>4. Registros electrofisiológicos de una sola célula

1. Para las grabaciones, utilice un microscopio vertical de platina fija equipado con objetivos de inmersión en agua, Dodt o contraste de interferencia diferencial infrarrojo (IR-DIC) y epifluorescencia, así como una cámara de dispositivo de carga acoplada refrigerada (CCD). Para la adquisición de datos, utilice un amplificador de pinza de parche, una etapa principal, una placa de interfaz de analógico a digital / digital a analógico (AD/DA) y una computadora (incluido el software de grabación).
2. Prepare un stock de 10-20 pipetas de parche (4-7 MΩ). Extraiga pipetas de capilares de vidrio de borosilicato (1,50 mm de diámetro exterior [OD]/0,86 mm de diámetro interior [ID]) con un extractor de micropipetas y pula al fuego con una microforge.
   nota: El pulido al fuego de las puntas de pipeta es crucial cuando se parchean las VSN bastante pequeñas. Esto ayudará a evitar la ruptura de la membrana celular al aplicar presión negativa para obtener un sellado de alta resistencia. Después del pulido, la abertura de la pipeta debe ser de aproximadamente 1 μm.
3. Mantenga las pipetas en un frasco de almacenamiento de pipetas para evitar daños y acumulación de polvo hasta su uso.
4. Preparar el sistema de perfusión llenando los depósitos de solución y los tubos de acuerdo con el diseño experimental.
   nota: Elimine completamente las burbujas de aire de los tubos, ya que interferirán fuertemente con las grabaciones electrofisiológicas.
5. Ajuste la presión para lograr un flujo de ~3 ml/min.
   nota: Las altas presiones causarán el movimiento del corte de tejido, así como la terminación de los registros electrofisiológicos.
6. Transfiera el corte VNO a la cámara de imágenes y fije la posición del corte utilizando un anclaje de acero inoxidable cableado con fibras sintéticas de 0,1 mm de espesor (Figura 2B-C).
   nota: No cubra la rodaja de tejido con uno de los hilos de fibra sintética, sino con la agarosa que rodea la rodaja.
7. Transfiera la cámara de imágenes a la configuración de grabación y superfusione continuamente el corte con S₂ oxigenado a temperatura ambiente a través de una aplicación de baño.
8. Ajuste el capilar de succión a la superficie de la solución para crear una succión lenta para el intercambio constante de la solución del baño. Ajuste el "lápiz de perfusión" de múltiples cilindros 8 en 1 por encima y cerca de la parte no sensorial del corte de VNO que contiene el vaso sanguíneo (Figura 2C, 3A). Será beneficioso colocar el lápiz de perfusión y la pipeta de grabación de manera que estén orientados hacia la rebanada desde direcciones opuestas.
9. Conecte el electrodo de referencia y la solución de baño usando un puente de agar en forma de L (lleno con 150 mM de KCl).
10. Llene la pipeta de parche con la solución de pipeta S₄.
11. Monte la pipeta sobre el electrodo de parche recubierto de cloruro de plata conectado a la platina de la cabeza sin raspar el recubrimiento y fíjela firmemente.
12. Aplique una ligera presión positiva (aproximadamente 1 ml en una jeringa de plástico de 10 ml) a la pipeta de parche antes de entrar en el baño.
13. Baje la pipeta en el baño utilizando micromanipuladores lo suficientemente lejos como para poder sumergir el objetivo sin golpearlo (Figura 2D).
14. Monitorice la resistencia de la pipeta (R_pip, entre 4 y 7 MΩ) mediante un software de electrofisiología conectado a la platina de cabeza.
    nota: Si R_pip es <4 MΩ, la punta del vidrio está rota. Si R _pip es >10 MΩ, lo más probable es que la punta esté obstruida y que la pipeta deba ser reemplazada.
15. Visualice el corte VNO con una cámara CCD que utilice contraste de interferencia diferencial (DIC) optimizado para infrarrojos e identifique las células que expresan FPR-rs3-i-Venus (FPR-rs3: secuencia 3 relacionada con el receptor del péptido formilo) (o neuronas marcadas de manera similar) utilizando iluminación de fluorescencia y un cubo de filtro adecuado.
16. Enfoque y orientación de células fluorescentes o no fluorescentes en función del diseño experimental.
17. Para acercarse al cuerpo de la célula, utilice volantes para obtener la máxima sensibilidad. Debido a la presión positiva, una pequeña abolladura en la membrana del soma celular se hace visible una vez que la punta de la pipeta está muy cerca.
18. Libere la presión positiva y aplique una ligera presión negativa para aspirar la membrana celular con el fin de obtener un sello de alta resistencia (1-20 GΩ). Aplique una succión corta y suave para romper la membrana celular y establecer la configuración de toda la célula.
19. Monitoree constantemente la resistencia de acceso durante el experimento.
    nota: Solo incluya las neuronas que muestren una resistencia de acceso pequeña y estable (≤3% de la_entrada de R; cambio <20% en el transcurso del experimento) en el análisis.

Resultados

Figura 1: Disección del VNO. (A) Vista lateral de la cabeza del ratón para ilustrar la posición y el ángulo en el que se cortan los incisivos. (B) Vista ventral que representa el mejor punto para agarrar y pelar el paladar superior (UP). (C) Vista ventral de la cápsula de cartílago (CC) que alberga el VNO y el hueso vómer (VB) después de extirpar el ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
productos químicos
Agarosa (baja temperatura de gelificación)	PeqLab	35-2030
ATP (Mg-ATP)	Sigma-Aldrich	A9187
Ácido bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES)	Sigma-Aldrich	B9879
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	C1016
Ácido etilenglicol tetraacético (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
glucosa	Sigma-Aldrich	G8270
GTP (Na-GTP)	Sigma-Aldrich	51120
Ácido (2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Cloruro de potasio	Sigma-Aldrich	P9333
Hidróxido de potasio	Sigma-Aldrich	3564
cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7653
Hidrogenocarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S5761
hidróxido sódico	Sigma-Aldrich	S8045
Herramientas quirúrgicas y consumibles
Placa de Petri grande, 90 mm	VWR		decapitación, disección de la cápsula VNO
Placa de Petri pequeña, 35 mm	VWR		tapa para disección de VNO, plato para incrustar en agarosa
Tijera quirúrgica grande y afilada	Herramientas de Bellas Ciencias		decapitación, extirpación de la mandíbula inferior
Tijeras de hueso fuertes	Herramientas de Bellas Ciencias		corte de incisivos
Pinzas medianas, pinzas Dumont #2	Herramientas de Bellas Ciencias		Eliminación de la piel y el paladar
Micro tijera de muelle, 8,5 cm, curva, hojas de 7 mm	Herramientas de Bellas Ciencias		Eliminación de VNO
Dos pares de pinzas finas, pinzas Dumont #5	Herramientas de Bellas Ciencias		disección de VNO a partir de una cápsula cartilaginosa
Espátula pequeña de acero inoxidable	Herramientas de Bellas Ciencias		Manipulación de bloques de agarosa y rodajas de tejido
Bisturí quirúrgico			corte de bloque de agarosa en forma piramidal
equipo
amplificador	HEKA Elektronik	EPC-10
Capilares de vidrio de borosilicato (1,50 mm de diámetro exterior/0,86 mm de diámetro interior)	Productos Científicos
Cámara CCD	Microsistemas Leica	DFC360FX
Cubo de filtro, excitación: BP 450-490, supresión: LP 515	Microsistemas Leica	I3
Lámpara de fluorescencia	Microsistemas Leica	EL6000
Agitador magnético de placa calefactora	Snijders	34532
Microforja	Narishige	MF-830
Dispositivo micromanipulador	Luigs & Neumann	SM-5
Extractor de micropipetas, vertical de dos pasos	Narishige	PC-10
microscopio	Microsistemas Leica	CSM DM 6000 SP5
Eliminador de ruido 50/60 Hz (HumBug)	Misión Científica
objetivo	Microsistemas Leica	HCX APO L20x/1.00 W
osciloscopio	Tektronik	TDS 1001B
osmómetro	Gonotec	Osmomat 030
Sistema de perfusión 8 en 1	AutoMate Científico
Medidor de pH cinco fácil	Mettler Toledo
Tarro de almacenamiento de pipetas	Instrumentos de precisión mundial	E212
Cámara de grabación	Luigs & Neumann	Mini cámara de lonchas
Afeitar	Wilkinson Sword GmbH	Espada Wilkinson Clásica
Cámara de almacenamiento de rebanadas oxigenantes; las cámaras comerciales alternativas son, por ejemplo, BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) o la Pre-cámara (BSC-PC; Warner Instruments)	Hecho a medida
Microscopio estereoscópico	Microsistemas Leica	S4E
Interfaz de disparo	HEKA Elektronik	TIB-14 S
Vibratomo	Microsistemas Leica	VT 1000 S
Baño de agua	Memmert	WNB 45