Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Medicamentos para la microiontoforesis
NOTA: Los medicamentos utilizados para la microiontoforesis deben tener una carga eléctrica cuando se disuelven en agua. Revise la bibliografía para ver si el medicamento de interés es apropiado para este procedimiento. Aquí se describe el procedimiento de la gabazina, un antagonista del receptor GABAA.
- Filtre el agua destilada con un filtro de jeringa de 0,2 μm para esterilizarla y asegurarse de que no contiene solutos. Con esta agua destilada, prepare ~1.000 μl de 20 mM de gabazina.
- Ajuste el pH de la dilución a 4 con NaOH filtrado de 0,2 μm utilizando un electrodo de pH de punta fina.
- Almacenar 100 - 200 μl de alícuotas a -20 ºC. Descongelar el día del registro. Ese día, antes de sujetar al animal, llene los cilindros (3 - 5 μl) del electrodo multibarril con los fármacos, utilizando una microjeringa de 100 μl provista de una aguja de plástico flexible.
>2. Cirugía e implantación de postes de cabeza
- Realizar experimentos en dos ratones machos CBA/J (Mus musculus) con pesos de 27 y 30 g.
- En los días previos a la cirugía, manipule a los animales y permítales explorar libremente en la cámara de grabación para que se habitúen a ella. Realice tres sesiones al día, cada una con una duración mínima de 30 minutos. Esto los calmará y hará que se sientan cómodos durante las grabaciones.
- Anestesiar al ratón con una mezcla de ketamina (50 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) inyectada por vía intramuscular. Esta dosis anestesia profundamente al animal durante aproximadamente 1 hora. Administre dosis suplementarias de un tercio de la dosis inicial, según sea necesario.
- Coloque al animal sobre una manta térmica configurada para mantener una temperatura de 38 ± 1 ºC y estabilice la cabeza del animal en un marco estereotáxico utilizando dos barras para las orejas y una barra de mordida. Tenga cuidado de no perforar la membrana timpánica con las barras de la oreja.
- Protege los ojos aplicando una gota de gel oftálmico.
- Afeitar el cuero cabelludo con unas tijeras y aplicar povidona yodada para desinfectar la piel.
- Con un bisturí, haga una incisión a lo largo de la línea media para exponer el cráneo y retraer el periostio que cubre el parietal y la parte más rostral de los huesos occipitales.
- Pegue un poste de cabeza de duraluminio liviano (peso ~ 0,65 g, longitud 30 mm, Figura 1A) con una base redonda y plana (5 mm de diámetro) en el cráneo. Pega un alambre plateado en el centro del poste de la cabeza dejando sus extremos libres. El alambre de plata se utilizará como electrodo de referencia para el registro electrofisiológico.
- Aplique una capa delgada de adhesivo fotopolimerizable en el cráneo y la base del poste de la cabeza. Espere 10 segundos y coloque el poste de la cabeza sobre el área rostral de los huesos parietales, a lo largo de la línea media.
- Fotocure el adhesivo con una fuente de luz azul durante 20 segundos para obtener una fuerza de unión efectiva.
- Taladre tres agujeros alrededor y detrás de la base del poste de cabeza con un taladro eléctrico y una broca pequeña.
- Coloque dos tornillos de reloj (~ 2 mm de longitud) en los orificios perforados para que sirvan como puntos de contacto adicionales entre el cráneo y el escenario principal. Los tornillos requieren 11/2 vueltas para lograr un ajuste perfecto. Pruebe los tornillos con pinzas para asegurarse de que no estén sueltos.
- Inserte la punta del cable de tierra plateado en el tercer orificio, asegurándose de que entre en contacto con la duramadre. Aplica una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato resistente al agua para unir el alambre al cráneo.
- Aplique un compuesto fotopolimerizable para reforzar la unión del poste de la cabeza con el cráneo. Cubra la base del poste de la cabeza, la parte inferior del cable plateado y los tornillos, teniendo cuidado de no extenderse detrás de lambda para permitir el acceso durante la grabación. Cura con una fuente de luz azul.
- Retrae el músculo en la parte posterior del cuello cerca de su inserción en el cráneo. Con una trépano pequeña (2,35 mm de diámetro), perfore una ventana redonda justo debajo de la sutura lambda y lateral a la línea media, para exponer el colículo inferior (CI). Levante el hueso que lo cubre con pinzas finas cuando los bordes estén sueltos. Si se produce sangrado, enjuague con solución salina estéril fría para detenerlo.
- Use compuesto para hacer una pared pequeña (~ 1 mm de ancho y ~ 1 mm de alto) alrededor de la ventana y cúrela con luz.
- Cubra el cráneo y el músculo expuestos con una pomada antibiótica. A continuación, humedece la superficie expuesta del CI con solución salina estéril y cúbrela con vaselina, llenando el pocillo generado después de hacer la pared alrededor de la ventana de grabación.
- Inyectar buprenorfina por vía subcutánea (0,03 mg/kg, diluido 1:10 en solución salina estéril) como analgésico.
- Mantenga al animal en la manta térmica hasta que se despierte y devuélvalo a su jaula de alojamiento para recuperarse de la cirugía durante tres días antes de las sesiones de grabación. Aloje a los animales en jaulas individuales para ratas para evitar que los compañeros de jaula limpien la gelatina y que el poste de la cabeza toque la cubierta de rejilla metálica. Coloque un poco de enriquecimiento en la jaula cuando el animal tenga una sola casa. Además, cambie el aserrín diariamente para prevenir infecciones y verifique cuidadosamente que el animal se recupere adecuadamente y no muestre signos de molestias. Además, verifique si la vaselina está sobre la ventana de grabación protegiendo el cerebro expuesto.
>3. Registro electrofisiológico y microiontoforesis
- Después de la recuperación, dale tiempo al animal para que se aclimate al entorno de grabación y sujete su cabeza. Aclimata al animal fijando el poste de la cabeza al soporte mientras el ratón se sienta sobre un protector de espuma acolchado hecho a medida tallado según el tamaño de su cuerpo (Figura 1B). Esto limitará los movimientos del ratón y contribuirá a su calma.
- Comience con sesiones de 10 min y aumente progresivamente la duración hasta 120 min. Durante la sesión, recompense a los animales con líquidos dulces (leche condensada, diluida 30:70 en agua) a intervalos determinados. Más tarde, durante la sesión de grabación, dé la misma recompensa al inicio y al final de la sesión o mientras no se aísle ninguna neurona.
- Si el animal está excitado antes del grabado, inyecte el sedante suave acepromazina (2 mg/kg, intraperitoneal). De acuerdo con el sistema neuronal de interés, el sedante puede afectar sus resultados.
- Deje que el animal explore libremente la cámara de grabación durante 5 a 10 minutos.
- Coloque el cuerpo del animal en el sujetador acolchado de espuma hecho a medida (Figura 1B).
- Asegure el poste de la cabeza a un soporte unido al marco estereotáctico (Figura 1C). Este es un buen momento para darle al animal una recompensa líquida.
- Cubra el cuerpo del animal con una manta de algodón y asegúrelo sin apretar con un hemicilindro de plástico y cinta adhesiva.
- Retire la vaselina de la ventana de grabación y enjuague con solución salina estéril tibia.
- Registre la actividad neuronal y la aplicación iontoforética de gabazina.
- Coloque el electrodo multibarril en su soporte, controlado por un microaccionamiento y conectado a un micromanipulador.
- Conecte los cables para grabar con pequeñas pinzas de cocodrilo. Conecte el terminal positivo al extremo del electrodo de tungsteno y el terminal de tierra al cable plateado que entra en contacto con la duramadre.
- Coloque un alambre de plata sin recubrimiento dentro de cada barril para que un extremo entre en contacto con la solución y el otro sea accesible. Conecte esos extremos al dispositivo de microiontoforesis, siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Mueva el electrodo multibarril hasta que la punta entre en contacto con la superficie del cerebro. Aplique solución salina estéril tibia para prevenir la desecación del tejido cerebral. En ese punto, aplique una corriente de retención (-10 nA para la gabazina; consulte la literatura para el medicamento en particular) para evitar fugas del medicamento desde la punta del barril mientras busca actividad de una sola unidad.
- Utilizar técnicas estándar para aislar la actividad extracelular de una sola neurona. Obtener el área de respuesta en frecuencia (FRA) de la neurona, es decir, la combinación de frecuencias e intensidades capaces de evocar una respuesta debido a que la neurona es sensible a estos sonidos.
- Elija dos frecuencias (f1 y f2) que evoquen una velocidad y un patrón de disparo similares. Presente cada una de esas frecuencias como estímulos raros y repetitivos bajo el paradigma de los excrechos.
nota: Brevemente, en el paradigma oddball, una frecuencia (f1) se presenta como el estímulo repetitivo con una alta probabilidad de ocurrencia, mientras que la segunda (f2) es el estímulo desviado que ocurre raramente, intercalado aleatoriamente entre los repetitivos. En una segunda secuencia extraña, las probabilidades relativas de los dos estímulos se invierten.
- Libere la gabazina cambiando la corriente a valores positivos (10 - 20 nA). Obtenga el FRA nuevamente y repita el paradigma extraño bajo la aplicación de gabazina. Mantenga la eyección hasta que se observe un efecto visible en la velocidad de disparo; Por lo general, tarda de 5 a 20 minutos, dependiendo del medicamento en particular, su concentración y la magnitud de la corriente de eyección. Repita el protocolo de registro para obtener los valores bajo el efecto del medicamento.
- Detenga la inyección devolviendo los valores actuales a los valores de retención. Espere a que el efecto de la droga se desvanezca monitoreando si el FRA o la respuesta al paradigma extraño vuelve a los valores de control.
nota: Las sesiones de grabación pueden durar de 2 a 3 horas por día y deben terminarse antes si el animal muestra algún signo de incomodidad o lucha. Dé recompensa líquida y cubra la cámara de grabación con vaselina.
