Registro de la actividad electrofisiológica de la red neuronal en un cocultivo neurona-astrocito

Resumen

Fuente: Taga, A., et al. Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para modelar la ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas de la región. J. Vis. Exp. (2021).

Este video demuestra el establecimiento de un cocultivo neurona-astrocito para registrar la actividad de la red neuronal. Al establecer el cocultivo de neuronas motoras y astrocitos en una placa de matriz de electrodos múltiples (MEA), la actividad eléctrica rítmica sincrónica de la red neuronal se registró extracelularmente utilizando el MEA.

Protocolo

1. Co-cultivo de astrocitos MN y de médula espinal en placas de matriz de electrodos múltiples

1. Diferenciar y colocar placas en las neuronas motoras y los astrocitos cuando estén listos para ser utilizados el mismo día y envejecidos hasta el día in vitro (DIV) 60 para las neuronas motoras y DIV 90 para los astrocitos.
2. Cubra las placas MEA el día anterior o el día del enchapado de la siguiente manera si trabaja con placas de plástico de 24 pocillos (Tabla de materiales).
3. Diluir poliornitina (PLO) en agua o solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta 100 μg/mL.
   1. Añada 15-20 μL a cada pocillo (dependiendo del nivel de comodidad de la pipeta), formando una gota en el centro del pocillo que cubre el área de los electrodos y el área circundante, pero no la totalidad del pocillo.
   2. Tenga cuidado de no dañar los electrodos con la punta de la pipeta. Sea consistente con el volumen de pozo a pozo para asegurar la cobertura de la misma superficie en cada pozo.
   3. Incubar PLO a 37 °C durante un mínimo de 1 h (preferiblemente 2 h).
      nota: Los volúmenes pequeños se secarán si no hay suficiente humedad en las placas. Agregue agua a los compartimentos que rodean los pozos para garantizar una humedad suficiente durante el transcurso del recubrimiento y las grabaciones.
4. Aspire la mayor cantidad posible de PLO con una punta de micropipeta de plástico. Tenga cuidado de no tocar los electrodos. Lavar con 250 μL de agua tres veces. Si usa un aspirador de vacío para lavados, no permita que la punta se acerque a la guía de electrodos. Después del tercer lavado, retire la mayor cantidad de agua posible, utilizando la punta de una pipeta según sea necesario. Deje que la superficie se seque debajo de la cubierta de cultivo celular sin la tapa.
5. Una vez que las superficies de las placas estén secas, agregue laminina diluida a 10 μg/mL en PBS. Utilice 15-20 μL para cubrir cada guía de electrodos. Agregue agua a los compartimentos de humedad, vuelva a colocar la tapa y vuelva a colocar la placa a 37 °C en incubación durante un mínimo de 2 h hasta toda la noche.
6. El día de la siembra, enjuague los cultivos de neuronas motoras (MN) y astrocitos una vez con PBS y agregue tripsina al 0,05% a 37 °C para levantar las células (5 min). Recoger en un tubo cónico de 15 mL que contiene inhibidor de tripsina y lavar las placas con medio o base para asegurar que se recogen todas las células. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y resuspender con una pipeta de 1000 μL para generar 1 mL de suspensión de una sola célula. Al volver a suspender MN y astrocitos, cambie al medio de cocultivo (Tabla 1), con la adición de 20 μM de inhibidor de la proteína serina/treonina cinasa (ROCK-I) formador de espirales asociado a Rho.
7. Cuente el MN y los astrocitos en paralelo con un hemocitómetro. Mientras cuenta y hace cálculos, tape las suspensiones de celdas y colóquelas en una rejilla de espuma de poliestireno a 4 ° C.
8. Calcular el volumen necesario para resuspender los cultivos a una concentración de 5 x 10⁴ células por 5 μL para las neuronas motoras y de 2,5 x 10⁴ células por 5 μL para los astrocitos. Centrifugar las suspensiones de celdas de 1 mL a 300 x g durante 5 min y volver a suspender en el volumen calculado.
9. Calcule el número de pocillos deseados a sembrar y multiplíquelo por 5 μL de cada suspensión celular. Combine el volumen requerido de suspensiones de neuronas y astrocitos en una proporción de 1:1 y mezcle pipeteando hasta que estén completamente combinados (generalmente dos veces), pero evite ser demasiado agresivo.
10. Retire la laminina de cada pocillo de la placa MEA con una punta de pipeta. Transfiera 10 μL de la suspensión final de la celda combinada a cada pocillo, formando una pequeña gota que cubre la guía de electrodos para proporcionar una densidad de celda de 5 x 10⁴ MN y 2,5 x 10⁴ astrocitos por pocillo.
    nota: La alta densidad de células en la suspensión combinada requiere una resuspensión frecuente entre pocillos durante la etapa de siembra para garantizar recuentos de células precisos y consistentes.
11. Regrese las placas a la incubadora durante 20-30 minutos. Tenga cuidado de no alterar la gota de célula y permita que las células formen uniones iniciales en las placas.
12. Después de 20-30 min, agregue medios de cocultivo calientes + ROCK-I a cada pocillo pipeteando 250 μL en la pared de cada pocillo, seguido de 250 μL adicionales en la pared del mismo pocillo en el lado opuesto. Regrese la placa a la incubadora.
13. Examine las placas el día después de la siembra (día 1 de cocultivo). Si hay restos celulares significativos o células muertas, intercambie el medio por un medio de cocultivo fresco que contenga ROCK-I. De lo contrario, cambie el medio el segundo día después de la siembra (día 2 de cocultivo) al medio de cocultivo sin ROCK-I. Realice intercambios de medio medio (aspire el 50% y agregue el 60% del volumen final para tener en cuenta la evaporación) dos veces por semana.
14. Si se utilizan sistemas MEA con placas de vidrio de 30 mm de un solo pocillo (Tabla de Materiales), la preparación de la placa puede tardar 2 o más días. Siga los pasos a continuación para realizar esto.
15. Levante las células y los restos celulares de los cultivos anteriores de MEA con tripsina al 0,05% durante 5-15 min.
16. Aspirar tripsina y enjuagar tres veces con agua.
17. Esterilizar agregando etanol al 70% e incubar en la campana durante 10 min. Aspirar el etanol y luego enjuagar con agua tres veces.
18. Aplicar detergente aniónico al 1% con enzima proteasa en agua. Cubra los platos con una tapa y envuélvalos con una película termoplástica y papel de aluminio, y luego déjelos en un balancín a temperatura ambiente durante la noche.
19. Aspire el detergente y luego enjuague tres veces con agua.
20. Si planea almacenar los platos, agregue un volumen suficiente de agua. Cubra los platos con una tapa y envuélvalos con película termoplástica y papel de aluminio y déjelos en el refrigerador hasta el próximo uso.
21. Si planea recubrir, deje que la superficie se seque debajo de la cubierta de cultivo celular.
22. Si se necesita una esterilización adicional (p. ej., infección previa o uso no reciente), solo en este punto, exponga las placas MEA a la luz ultravioleta (UV) debajo del capó durante 30-60 min.
    nota: Evitar la luz ultravioleta frecuente evitará daños en los electrodos. El uso de luz ultravioleta cuando las placas tienen suero dará como resultado electrodos no funcionales, por lo que solo debe usarse en placas limpias.
23. Cuando las placas estén completamente secas, proceda con la limpieza con plasma durante 1 minuto para cargar la superficie de vidrio de las placas MEA y mejorar la eficacia del recubrimiento. Limpie con plasma al menos una vez cada 4-5 ciclos de ciclos de limpieza y enchapado de placas MEA.
    1. Como alternativa, cuando la limpieza con plasma no sea factible o no esté justificada, agregue un volumen suficiente de medio que contenga suero fetal bovino (FBS) para cubrir la superficie de las placas de MEA y devuélvalas a la incubadora durante la noche.
24. Utilice el recubrimiento PLO (poliornitina)/laminina. Añada la solución de PLO (100 μg en PBS) inmediatamente después de la limpieza con plasma o de la aspiración y enjuague del medio que contiene FBS.
25. Coloque las células en placas como se indica anteriormente a las siguientes densidades: 1 x 10⁵ astrocitos derivados de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-A)/placa y 5 x 10^{5 neuronas} motoras derivadas de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-MN)/placa.

>2. Grabación de guías multielectrodo

1. Extraiga los datos de voltaje bruto a una frecuencia de muestreo de 12,5 kHz, utilizando un filtro Butterworth con un filtro de paso alto de 200 Hz y un filtro de paso bajo de 3 kHz. Establezca el reconocimiento de picos como puntos de tiempo instantáneos de voltajes ≥6 desviaciones estándar de la línea de base. Identifique las ráfagas como una actividad con >5 picos en 100 ms. Defina la actividad de la red cuando más del 35% del total de electrodos activos se dispara dentro de los 100 ms con un mínimo de 50 picos por ráfaga de red.
2. Comience a grabar lo antes posible después del día 1.
   nota: La actividad eléctrica rara vez se notará antes del Día 3 de CC.
3. Placas de cultivos paralelos a densidades similares y se replican en las placas de cultivo o cubreobjetos apropiados para ensayos bioquímicos, inmunocitoquímica (ICC) o PCR cuantitativa (qPCR).
4. Realice grabaciones con la temperatura ajustada a 37 °C y CO₂ al 5%. Transfiera las placas a la máquina y deje que se equilibren durante al menos 5 minutos antes de grabar.
5. Registre la actividad basal cada dos días o semanalmente, durante 1-15 minutos, según el diseño experimental. No grabe durante al menos 1 hora después de un intercambio de medios, e idealmente espere 24 horas después de cada intercambio de medios.
6. Para evitar la contaminación, cambie el medio (es decir, medio intercambio de medio como en el paso 1.14) después de cualquier registro en el que la tapa de la placa estéril deba abrirse fuera de la campana estéril (es decir, la aplicación de compuestos farmacológicos). Realice intercambios completos de medios y lavados para lavar los medicamentos si las placas se van a seguir utilizando más allá del tratamiento farmacológico.
7. Para fines de análisis, utilice al menos tres réplicas técnicas y biológicas para cada condición. Exprese datos electrofisiológicos como medio de n ≥ 3 réplicas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo estériles de 10 cm	halcón	353003
25 cm2 matraces de cultivo estériles	halcón	353136
Sistema de filtro CA de 500 mL y 0,2 μm	Corning	430769
Pipeta de 5 mL	halcón	357543
6 placas de cultivo bien estériles	halcón	3046
Placas Axion CytoView MEA 24 (M384-tMEA-24W)	Axion	OPT-24
Plataforma Axion Edge MEA	Axion	Borde del Maestro
Matriz de membrana basal - Matrigel	Corning	354277	Detalles en el protocolo
Microscopio de sobremesa (estéril bajo campana de cultivo celular)	Zeiss	415510-1100-000	Primo Vert
Factor neurotrófico ciliar (CNTF)	Peprotech	450-13	Disuelva 100 μg en 1 ml de PBS estéril y, a continuación, añada 9 ml de BSA-PBS estéril al 0,1 % a 10 μg/mL. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 ng/mL).
Depósitos deCO2 y regulador para Axion Edge	AirGas/Harris	9296NC
DMEM/F12	Termopescador	113300	Concentración de trabajo 1x
Essential 8 Medio + Suplemento Essential 8	Termopescador	A1517001	Combine 10 ml de suplemento Essential 8 (10x) con 500 ml de Essential 8 Growth Medium (1x)
Suero fetal bovino (FBS)	Termopescador	16140071	Concentración de trabajo 1x
Hemotómetro	Ciencias de la Microscopía Electoral	63510-20
Incubadora de cultivo celular con control de humedad	ThermoFisher	370	ajustado a 37 ºC, 5 % CO2
Laminina	Termopescador	23017-015	Solución madre 1 mg/mL, concentración de trabajo 10 μg/mL (recubrimiento), 1 μg/mL (medio celular)
L-Glutamina	Termopescador	25030	Disuelva 2 mg de LDN en 500 μL de cloroformo para obtener 10 mM de caldo. Alícuota esta y congelar a -80 ºC. Para su uso, diluya primero el material de 1 a 10 en DMSO [a 1 mM], luego diluya 1:5000 de 1 mM en el medio deseado para obtener una solución de trabajo de 0,2 μM
Placas de vidrio MEA	Sistemas multicanal	60MEA200/30iR-Ti-gr	Concentración de trabajo 100x
pipeta multicanal P200	Gilson	PJ22224
Neurobasal	Termopescador	21103049
Aminoácidos no esenciales (NEAA)	Termopescador	11140050	Concentración de trabajo 1x
Pencillin/Estreptomicina	Termopescador	15140122	Concentración de trabajo 100x
Poliornitina (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	Concentración de trabajo 100x
Cloruro de potasio (KCl)	Na	Na	Disuelva 100 mg en 1 mL de ddW para obtener 100 mg/mL de solución madre. Alícuota el stock en tubos de 100 μL. (concentración de trabajo 100 μg/mL)
Purmorfamina (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Concentración de trabajo100 mM
Inhibidor de rocas	Peprotech	1293823	Centrifugar brevemente antes de la reconstitución. Disuelva 100 μg en 1 mL de PBS a 100 μg/mL, y luego agregue 9 mL de BSA-PBS estéril al 0,1% a 10 μg/mL. Alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1:1000 para su uso. (concentración de trabajo 10 ng/mL).
Campanas de cultivo celular estériles	Compañía Panadera	SG-600	Disolver 5 mg en 1480 μL de dH2O para obtener 10 mM de caldo, alícuota y congelar a -80 ºC. Diluir a 1:500 para su uso. (concentración de trabajo 20 μM).
Suplemento B - B27 Suplemento	Termopescador	21985023
Centrífuga de cultivo celular de mesa	ThermoFisher	75004261	Concentración de trabajo 50x
Película termoplástica - Parafilm	PARAFILM	Página 7793	Leyenda de Sorvall X1R
Tripsina-EDTA (0,05%)	Termopescador	2530054	Concentración de trabajo 1x
Baño de agua	ThermoFisher	Artículo 2332	Isotemp