Registro de la actividad electrofisiológica de la red neuronal en un cocultivo neurona-astrocito

1. Co-cultivo de astrocitos MN y de médula espinal en placas de matriz de electrodos múltiples

1. Diferenciar y colocar placas en las neuronas motoras y los astrocitos cuando estén listos para ser utilizados el mismo día y envejecidos hasta el día in vitro (DIV) 60 para las neuronas motoras y DIV 90 para los astrocitos.
2. Cubra las placas MEA el día anterior o el día del enchapado de la siguiente manera si trabaja con placas de plástico de 24 pocillos (Tabla de materiales).
3. Diluir poliornitina (PLO) en agua o solución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta 100 μg/mL.
   1. Añada 15-20 μL a cada pocillo (dependiendo del nivel de comodidad de la pipeta), formando una gota en el centro del pocillo que cubre el área de los electrodos y el área circundante, pero no la totalidad del pocillo.
   2. Tenga cuidado de no dañar los electrodos con la punta de la pipeta. Sea consistente con el volumen de pozo a pozo para asegurar la cobertura de la misma superficie en cada pozo.
   3. Incubar PLO a 37 °C durante un mínimo de 1 h (preferiblemente 2 h).
      nota: Los volúmenes pequeños se secarán si no hay suficiente humedad en las placas. Agregue agua a los compartimentos que rodean los pozos para garantizar una humedad suficiente durante el transcurso del recubrimiento y las grabaciones.
4. Aspire la mayor cantidad posible de PLO con una punta de micropipeta de plástico. Tenga cuidado de no tocar los electrodos. Lavar con 250 μL de agua tres veces. Si usa un aspirador de vacío para lavados, no permita que la punta se acerque a la guía de electrodos. Después del tercer lavado, retire la mayor cantidad de agua posible, utilizando la punta de una pipeta según sea necesario. Deje que la superficie se seque debajo de la cubierta de cultivo celular sin la tapa.
5. Una vez que las superficies de las placas estén secas, agregue laminina diluida a 10 μg/mL en PBS. Utilice 15-20 μL para cubrir cada guía de electrodos. Agregue agua a los compartimentos de humedad, vuelva a colocar la tapa y vuelva a colocar la placa a 37 °C en incubación durante un mínimo de 2 h hasta toda la noche.
6. El día de la siembra, enjuague los cultivos de neuronas motoras (MN) y astrocitos una vez con PBS y agregue tripsina al 0,05% a 37 °C para levantar las células (5 min). Recoger en un tubo cónico de 15 mL que contiene inhibidor de tripsina y lavar las placas con medio o base para asegurar que se recogen todas las células. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y resuspender con una pipeta de 1000 μL para generar 1 mL de suspensión de una sola célula. Al volver a suspender MN y astrocitos, cambie al medio de cocultivo (Tabla 1), con la adición de 20 μM de inhibidor de la proteína serina/treonina cinasa (ROCK-I) formador de espirales asociado a Rho.
7. Cuente el MN y los astrocitos en paralelo con un hemocitómetro. Mientras cuenta y hace cálculos, tape las suspensiones de celdas y colóquelas en una rejilla de espuma de poliestireno a 4 ° C.
8. Calcular el volumen necesario para resuspender los cultivos a una concentración de 5 x 10⁴ células por 5 μL para las neuronas motoras y de 2,5 x 10⁴ células por 5 μL para los astrocitos. Centrifugar las suspensiones de celdas de 1 mL a 300 x g durante 5 min y volver a suspender en el volumen calculado.
9. Calcule el número de pocillos deseados a sembrar y multiplíquelo por 5 μL de cada suspensión celular. Combine el volumen requerido de suspensiones de neuronas y astrocitos en una proporción de 1:1 y mezcle pipeteando hasta que estén completamente combinados (generalmente dos veces), pero evite ser demasiado agresivo.
10. Retire la laminina de cada pocillo de la placa MEA con una punta de pipeta. Transfiera 10 μL de la suspensión final de la celda combinada a cada pocillo, formando una pequeña gota que cubre la guía de electrodos para proporcionar una densidad de celda de 5 x 10⁴ MN y 2,5 x 10⁴ astrocitos por pocillo.
    nota: La alta densidad de células en la suspensión combinada requiere una resuspensión frecuente entre pocillos durante la etapa de siembra para garantizar recuentos de células precisos y consistentes.
11. Regrese las placas a la incubadora durante 20-30 minutos. Tenga cuidado de no alterar la gota de célula y permita que las células formen uniones iniciales en las placas.
12. Después de 20-30 min, agregue medios de cocultivo calientes + ROCK-I a cada pocillo pipeteando 250 μL en la pared de cada pocillo, seguido de 250 μL adicionales en la pared del mismo pocillo en el lado opuesto. Regrese la placa a la incubadora.
13. Examine las placas el día después de la siembra (día 1 de cocultivo). Si hay restos celulares significativos o células muertas, intercambie el medio por un medio de cocultivo fresco que contenga ROCK-I. De lo contrario, cambie el medio el segundo día después de la siembra (día 2 de cocultivo) al medio de cocultivo sin ROCK-I. Realice intercambios de medio medio (aspire el 50% y agregue el 60% del volumen final para tener en cuenta la evaporación) dos veces por semana.
14. Si se utilizan sistemas MEA con placas de vidrio de 30 mm de un solo pocillo (Tabla de Materiales), la preparación de la placa puede tardar 2 o más días. Siga los pasos a continuación para realizar esto.
15. Levante las células y los restos celulares de los cultivos anteriores de MEA con tripsina al 0,05% durante 5-15 min.
16. Aspirar tripsina y enjuagar tres veces con agua.
17. Esterilizar agregando etanol al 70% e incubar en la campana durante 10 min. Aspirar el etanol y luego enjuagar con agua tres veces.
18. Aplicar detergente aniónico al 1% con enzima proteasa en agua. Cubra los platos con una tapa y envuélvalos con una película termoplástica y papel de aluminio, y luego déjelos en un balancín a temperatura ambiente durante la noche.
19. Aspire el detergente y luego enjuague tres veces con agua.
20. Si planea almacenar los platos, agregue un volumen suficiente de agua. Cubra los platos con una tapa y envuélvalos con película termoplástica y papel de aluminio y déjelos en el refrigerador hasta el próximo uso.
21. Si planea recubrir, deje que la superficie se seque debajo de la cubierta de cultivo celular.
22. Si se necesita una esterilización adicional (p. ej., infección previa o uso no reciente), solo en este punto, exponga las placas MEA a la luz ultravioleta (UV) debajo del capó durante 30-60 min.
    nota: Evitar la luz ultravioleta frecuente evitará daños en los electrodos. El uso de luz ultravioleta cuando las placas tienen suero dará como resultado electrodos no funcionales, por lo que solo debe usarse en placas limpias.
23. Cuando las placas estén completamente secas, proceda con la limpieza con plasma durante 1 minuto para cargar la superficie de vidrio de las placas MEA y mejorar la eficacia del recubrimiento. Limpie con plasma al menos una vez cada 4-5 ciclos de ciclos de limpieza y enchapado de placas MEA.
    1. Como alternativa, cuando la limpieza con plasma no sea factible o no esté justificada, agregue un volumen suficiente de medio que contenga suero fetal bovino (FBS) para cubrir la superficie de las placas de MEA y devuélvalas a la incubadora durante la noche.
24. Utilice el recubrimiento PLO (poliornitina)/laminina. Añada la solución de PLO (100 μg en PBS) inmediatamente después de la limpieza con plasma o de la aspiración y enjuague del medio que contiene FBS.
25. Coloque las células en placas como se indica anteriormente a las siguientes densidades: 1 x 10⁵ astrocitos derivados de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-A)/placa y 5 x 10^{5 neuronas} motoras derivadas de células madre pluripotentes humanas (hiPSC-MN)/placa.

>2. Grabación de guías multielectrodo

1. Extraiga los datos de voltaje bruto a una frecuencia de muestreo de 12,5 kHz, utilizando un filtro Butterworth con un filtro de paso alto de 200 Hz y un filtro de paso bajo de 3 kHz. Establezca el reconocimiento de picos como puntos de tiempo instantáneos de voltajes ≥6 desviaciones estándar de la línea de base. Identifique las ráfagas como una actividad con >5 picos en 100 ms. Defina la actividad de la red cuando más del 35% del total de electrodos activos se dispara dentro de los 100 ms con un mínimo de 50 picos por ráfaga de red.
2. Comience a grabar lo antes posible después del día 1.
   nota: La actividad eléctrica rara vez se notará antes del Día 3 de CC.
3. Placas de cultivos paralelos a densidades similares y se replican en las placas de cultivo o cubreobjetos apropiados para ensayos bioquímicos, inmunocitoquímica (ICC) o PCR cuantitativa (qPCR).
4. Realice grabaciones con la temperatura ajustada a 37 °C y CO₂ al 5%. Transfiera las placas a la máquina y deje que se equilibren durante al menos 5 minutos antes de grabar.
5. Registre la actividad basal cada dos días o semanalmente, durante 1-15 minutos, según el diseño experimental. No grabe durante al menos 1 hora después de un intercambio de medios, e idealmente espere 24 horas después de cada intercambio de medios.
6. Para evitar la contaminación, cambie el medio (es decir, medio intercambio de medio como en el paso 1.14) después de cualquier registro en el que la tapa de la placa estéril deba abrirse fuera de la campana estéril (es decir, la aplicación de compuestos farmacológicos). Realice intercambios completos de medios y lavados para lavar los medicamentos si las placas se van a seguir utilizando más allá del tratamiento farmacológico.
7. Para fines de análisis, utilice al menos tres réplicas técnicas y biológicas para cada condición. Exprese datos electrofisiológicos como medio de n ≥ 3 réplicas.