Medición simultánea del calcio intracelular y del potencial de membrana en el endotelio cerebral de un ratón

Resumen

Fuente: Hakim, M. A. et al. Mediciones simultáneas de calcio intracelular y potencial de membrana en endotelio cerebral de ratón recién aislado e intacto. J. Vis. Exp. (2019)

El video muestra la medición simultánea de los niveles de calcio intracelular y los cambios en el potencial de membrana en las células endoteliales de los segmentos de la arteria cerebral del ratón. El tubo endotelial aislado se carga con un indicador de calcio fluorescente y se trata con un fármaco que induce la liberación de calcio intracelular, lo que da lugar a un cambio en el potencial de membrana. La fluorescencia del indicador permite la medición de los niveles de calcio, y se inserta un electrodo de registro en una célula para medir los cambios en el potencial de membrana.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

>1. Disección y aislamiento de la arteria cerebral

NOTA: Todos los procedimientos de disección requieren un aumento de la muestra (hasta 50x) a través de microscopios estereoscópicos e iluminación proporcionada por fuentes de luz de fibra óptica. Para realizar procedimientos de disección para aislar el cerebro y las arterias, use instrumentos de disección afilados. Las herramientas de microdisección para aislar y limpiar las arterias incluyen pinzas afiladas de punta fina y tijeras de disección estilo Vannas (hojas de 3 a 9,5 mm).

1. Aislamiento del cerebro de ratón
   1. Anestesiar a un ratón C57BL/6 (3-30 meses de edad; macho o hembra) mediante inhalación de isoflurano (3% durante 2-3 min), luego decapitar al animal inmediatamente después de la inducción completa de la anestesia. Coloque la cabeza en una placa de Petri (diámetro 10 cm, profundidad 1,5 cm) que contenga una solución salina fisiológica (PSS) Ca²⁺ cero fría (4 °C) bajo un microscopio estereoscópico.
   2. Viendo a través del microscopio, retire la piel y el vello sobre el cráneo y elimine el exceso de sangre con frío cero Ca²⁺ PSS. Haga una incisión usando solo las puntas de las tijeras de disección estándar (por ejemplo, una hoja de 24 mm), comenzando con el hueso occipital y extendiéndose hacia arriba a través del hueso nasal del cráneo.
   3. Abra el cráneo cuidadosamente a lo largo de la incisión con pinzas de punta gruesa y separe el tejido conectivo para aislar el cerebro con un Círculo de Willis intacto.
      NOTA: Alternativamente, se pueden usar pinzas para cortar huesos Littauer para abrir el cráneo y exponer el cerebro.
   4. Lave suavemente el cerebro aislado con cero Ca²⁺ PSS frío en un vaso de precipitados para eliminar la sangre. Coloque el lado ventral del cerebro hacia arriba en una cámara que contenga solución de disección fría para el aislamiento de las arterias cerebrales (Figura 1A).
2. Aislamiento de arterias cerebrales
   NOTA: La arteria cerebral posterior ha sido seleccionada como modelo de estudio endotelial cerebrovascular representativo para este protocolo.
   1. Asegure el cerebro aislado en una solución de disección fría utilizando clavijas de acero inoxidable (diámetro 0,2 mm, longitud ~11-12 mm) para insertarlas en un polímero de silicona con infusión de carbón vegetal que recubre el fondo (profundidad ≥50 cm) de una placa de Petri de vidrio.
   2. Para mantener una temperatura fría de PSS durante la disección, utilice una cámara de disección enfriada por un sistema de refrigerante que cicle continuamente una mezcla de agua y etilenglicol 1:1. Alternativamente, la disección se puede realizar con hielo fresco.
   3. Aísle quirúrgicamente las arterias cerebrales posteriores (segmentos de ~0,3 a 0,5 cm, sin tensión axial) de las arterias comunicantes y basilares posteriores utilizando instrumentos de microdisección, tijeras estilo Vannas y pinzas afiladas de punta fina (Figura 1B). Utilice clavijas de acero inoxidable (diámetro 0,1 mm, longitud ~13-14 mm) para asegurar ambas arterias cerebrales posteriores aisladas en la solución de disección en la placa de Petri (Figura 1C).
   4. Limpie cuidadosamente las arterias cerebrales posteriores aisladas mediante la extracción del tejido conectivo con pinzas afiladas de punta fina (Figura 1D). Corte las arterias intactas en segmentos (longitud de 1 a 2 mm) para la digestión enzimática (Figura 1D; recuadro).

>2. Preparación del tubo endotelial y superfusión

1. Prepare el aparato de trituración utilizando un microscopio equipado con objetivos (10x, 20x y 40x), una cámara y una platina de aluminio que sostenga una cámara y micromanipuladores. Asegure una microjeringa con un controlador de bomba adyacente a la platina y la muestra (Figura 2A).
2. Rellene completamente una pipeta de trituración con aceite mineral y asegúrela sobre el pistón de la microjeringa. A continuación, utilizando la microjeringa con controlador de bomba, extraiga la solución de disociación en la pipeta (~130 nl) sobre el aceite mineral asegurándose de que no haya burbujas de aire en la pipeta.
3. Coloque los segmentos arteriales intactos en 1 mL de solución de disociación en un tubo de vidrio de 10 mL (Figura 2B), que contenga 0,31 mg/mL de papaína, 0,5 mg/mL de ditioeritritol, 0,75 mg/mL de colagenasa y 0,13 mg/mL de elastasa. Incubar a 34 °C durante 10-12 min para una digestión parcial.
4. Después de la digestión, reemplace la solución enzimática con ~ 5 mL de solución de disociación fresca. Con una pipeta de 1 mL, transfiera un segmento a una cámara que contenga la solución de disociación a temperatura ambiente (RT).
5. Coloque la pipeta en la solución de disociación de la cámara y colóquela cerca de un extremo del recipiente digerido. Ajuste una tasa dentro del rango de 2 a 5 nL/s en el controlador de la bomba para una trituración suave (Figura 2C; recuadro).
6. Mientras observa a través de un aumento de 100x a 200x, retire y expulse el segmento arterial para disociar las células del músculo liso mientras produce un tubo endotelial. Si es necesario, use cuidadosamente pinzas de punta fina para separar la adventicia disociada y la lámina elástica interna del tubo endotelial. Confirmar que todas las células del músculo liso están disociadas y que solo las células endoteliales permanecen como un "tubo" intacto (Figura 2C).
7. Con el uso de micromanipuladores, asegure cada extremo del tubo endotelial en el cubreobjetos de vidrio de la cámara de superfusión con pipetas de fijación de vidrio de borosilicato (Figura 2D).
8. Lave las adventicias disociadas y las células musculares lisas de la cámara y reemplace la solución de disociación con 2 mM de CaCl₂ PSS. Transfiera la plataforma móvil con tubo endotelial asegurado al microscopio de superfusión y plataforma experimental.
9. Utilice 6 reservorios limpios de 50 mL (Figura 3A) para la administración continua de PSS y las respectivas soluciones farmacológicas durante el experimento, según corresponda. Utilice la válvula de control de flujo en línea para configurar manualmente el caudal en todo momento de manera consistente con el flujo laminar mientras hace coincidir la alimentación de flujo con la succión al vacío. Administre PSS a la cámara (Figura 3B) para la superfusión del tubo endotelial durante ≥ 5 minutos antes de registrar los datos de fondo y la carga de colorante.

>3. Ajustes de carga de tinte, lavado y temperatura

1. Encienda todos los componentes del sistema de fotometría para medir [Ca²⁺]_i. Utilice el microscopio del equipo experimental (Figura 3C) para ver el tubo endotelial con un aumento de 400x y concéntrese en las células de la ventana fotométrica utilizando el paquete de software del sistema de fotometría.
2. Mida el diámetro del tubo endotelial y registre los valores de autofluorescencia de fondo de acuerdo con la emisión de 510 nm durante la excitación alterna a 340 y 380 nm (≥10 Hz).
3. Para medir las respuestas intracelulares de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i), cargue el tubo endotelial con colorante Fura-2 AM (éster de Fura-2-acetoximetílico, concentración final de 10 μM) a RT y deje ~30-40 min en ausencia de luz.
4. Reinicie la superfusión del tubo endotelial con PSS fresco durante ~30-40 min para lavar el exceso de tinte y permitir que Fura-2 AM intracelular se desesterifique. Durante el período de lavado, eleve la temperatura gradualmente de RT a 37 °C utilizando el controlador de temperatura (Figura 3A) con un calentador en línea, luego manténgala a 37 °C durante todo el experimento.
   nota: La transición incremental recomendada entre RT y 37 °C implica tres pasos (por ejemplo, 5 °C) con un tiempo de equilibrio de ≥5 minutos en cada paso.

>4. Medición simultánea de [Ca²⁺]_i y V_m

1. Encienda todos los demás equipos y el paquete de software de electrómetro para medir el potencial de membrana (V_m, consulte la Figura 3, la Figura 4). Ajuste la velocidad de adquisición de datos en consecuencia (≥10 Hz).
2. Tire de un electrodo afilado y rellene con 2 M KCl. Para estudios de acoplamiento intercelular mediante transferencia de colorante, rellene los microelectrodos con yoduro de propidio al 0,1% disuelto en KCl 2 M.
3. Asegure el electrodo sobre un alambre plateado recubierto de cloruro en el soporte de pipeta conectado a una etapa de cabeza de electrómetro asegurada con un micromanipulador. Utilice el micromanipulador para colocar brevemente la punta del electrodo en el PSS que fluye en la cámara mientras mira a través del objetivo 4x.
4. Ajuste el V_m en reposo a 0 según sea consistente con el potencial del baño conectado a tierra. Coloque la punta del electrodo justo encima de una celda del tubo endotelial. Si lo desea, utilice monitores de referencia audibles conectados a electrómetros para asociar el tono del sonido con las posibles grabaciones.
5. Aumente el aumento a 400x usando el objetivo de 40x y vuelva a colocar la punta del electrodo según sea necesario. Ajuste la ventana fotométrica utilizando el software de fotometría para enfocarse en ~50 a 80 células endoteliales.
6. Coloque suavemente el electrodo en una de las celdas del tubo endotelial con el micromanipulador y espere ≥2 min para que el V_m en reposo se estabilice. Del mismo modo, inserte un segundo electrodo en otra celda (distancia ≥100 μm) de la primera celda empalada con el primer electrodo.
7. Una vez que el V_m en reposo esté estable en sus valores esperados (-30 a -40 mV), encienda el PMT en la interfaz de fluorescencia en ausencia de luz y comience la adquisición de [Ca²⁺]_i intracelular excitando Fura-2 alternativamente (10 Hz) a 340 y 380 nm mientras recolecta la emisión de fluorescencia a 510 nm.
   NOTA: Para probar el acoplamiento eléctrico intercelular, la corriente (± 0.5-3 nA, ~20 s de duración del pulso) se puede suministrar a través de un electrómetro como "Sitio 1", y los cambios de V_m se pueden registrar con otro electrómetro como "Sitio 2" (distancia ≥100 μm).
8. Una vez que se establecen las mediciones simultáneas de V_m y [Ca²⁺]_i, espere ~ 5 min para la superfusión del tubo endotelial con PSS a una tasa de flujo laminar constante antes de la aplicación de los fármacos.
9. Aplique el fármaco (por ejemplo, trifosfato de adenosina [ATP]) preparado en PSS a la cámara de superfusión con un caudal constante. Después de ~ 3 min (o un período de tiempo apropiado para la cinética del medicamento), lave con PSS hasta que V_m y la relación F₃₄₀ / F₃₈₀ vuelvan a sus condiciones iniciales. Marque las grabaciones respectivas como sincronizadas temporalmente en los paquetes de software de fotómetro y electrómetro durante cada transición de soluciones.
10. Una vez finalizado el experimento, retire el electrodo de la celda con el micromanipulador y observe V_m ~ 0 mV según la referencia del electrodo de baño. Detenga las grabaciones respectivas de V_m y [Ca²⁺]_i y guarde los registros en el archivo para el análisis de datos.

Resultados

Figura 1: Aislamiento de la arteria cerebral del cerebro. (A) Cerebro aislado con arterias intactas (la flecha blanca indica la arteria cerebral posterior) en solución de disección. (B) Vista ampliada de la arteria cerebral posterior (flecha blanca; ~3x vs. Panel A). (C) Arterias cerebrales posteriores aisladas aseguradas con clavijas de ace...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
glucosa	Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Estados Unidos)	G7021
NaCl	sigma	S7653
MgCl2	sigma	M2670
CaCl2	sigma	223506
HEPES	sigma	H4034
Kcl	sigma	P9541
NaOH	sigma	S8045
ATP	sigma	A2383
Hcl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.)	A466250
Colagenasa (mezcla tipo H)	sigma	C8051
Ditioeritritol	sigma	D8255
papaína	sigma	P4762
elastasa	sigma	E7885
Bsa	sigma	A7906
Yoduro de propidio	sigma	P4170
Dmso	sigma	D8418
Tinte Fura-2 AM	Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos	F14185
Enfriador de recirculación (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Cámara de superfusión de plexiglás	Warner Instruments, Camden, CT, EE. UU.	RC-27
Funda de vidrio (2,4 × 5,0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Plataforma de aluminio anodizado (diámetro: 7,8 cm)	Instrumentos Warner	PM6 o PH6
Escenario compacto de aluminio	Siskiyou, Grants Pass, Oregón, Estados Unidos	8090P
Micromanipulador	Siskiyou	MX10
Microscopios estereoscópicos	Zeiss, Nueva York, Estados Unidos	Stemi 2000 y 2000-C
Fuentes de luz de fibra óptica	Schott, Maguncia, Alemania y KL200, Zeiss	Fostec 8375
Microscopio invertido Nikon	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, EE. UU.	TS2
Objetivos de contraste de fase	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X y 20X)
Objetivos fluorescentes	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) y 40X (Plan Fluor)
Microscopio invertido Nikon	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Controlador de bomba de microjeringa (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, EE. UU.	SYS-MICRO4
Mesa de aislamiento de vibraciones	Fabricación técnica, Peabody, MA, EE. UU.	Micro-g
Amplificadores	Dispositivos moleculares, Sunnyvale, CA, EE. UU.	Axoclamp 2B y Axoclamp 900A
Cabeceras	Dispositivos moleculares	HS-2A y HS-9A
Generador de funciones	EZ Digital, Seúl, Corea del Sur	FG-8002
Sistema de adquisición de datos	Dispositivos moleculares, Sunnyvale, CA, EE. UU.	Digidata 1550A
Monitores de referencia audibles	Ampol US LLC, Sarasota, FL, EE. UU.	BM-A-TM
Osciloscopio de almacenamiento digital	Tektronix, Beaverton, Oregón, Estados Unidos	TDS 2024B
Interfaz de sistema de fluorescencia, lámpara ARC + fuente de alimentación, hiperinterruptor, PMT	Dispositivos moleculares, Sunnyvale, CA, EE. UU.	Sistemas IonOptix
Controlador de temperatura	Instrumentos Warner	TC-344B o C
Calentador en línea	Instrumentos Warner	SH- 27B
Controlador de válvulas	Instrumentos Warner	VC-6
Válvula de control de flujo en línea	Instrumentos Warner	FR-50
Tirador electrónico	Sutter Instruments, Novato, CA, EE. UU.	P-97 o P-1000
Microforja	Narishige, East Meadow, Nueva York, Estados Unidos	MF-900
Tubos de vidrio de borosilicato (trituración)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, EE. UU.	1B100-4
Tubos de vidrio de borosilicato (fijación)	Instrumentos Warner	G150T-6
Tubos de vidrio de borosilicato (electrodos afilados)	Instrumentos Warner	GC100F-10
Filtro de jeringa (0,22 μm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Placa de Petri de vidrio + Sylgard de carbón	Instrumentación de Sistemas Vivos, St. Albans City, VT, EE. UU.	DD-90-S-BLK
Tijeras estilo Vannas (3 mm y 9,5 mm)	Instrumentos de precisión mundial	555640S, 14364
Tijeras de 3 y 7 mm	Fine Science Tools (o FST), Foster City, CA, EE. UU.	Moria MC52 y 15000-00
Pinzas afiladas de punta fina	FST	Dumont #5 y Dumont #55