Evaluación de la formación de conexiones neuronales en un cocultivo mediante registros electrofisiológicos

Resumen

Fuente: Su, C. T. E., et al. Un enfoque optogenético para evaluar la formación de conexiones neuronales en un sistema de cocultivo. J. Vis. Exp. (2015)

El video muestra la grabación electrofisiológica para evaluar las conexiones neuronales entre las neuronas corticales derivadas de iPSC y las de rata, confirmando los contactos sinápticos en el cocultivo mediante la activación de canales iónicos sensibles a la luz y la detección de corrientes postsinápticas.

Protocolo

1. Registros electrofisiológicos de neuronas derivadas de iPSC

1. Confirmar si las iPSC humanas se comportan como neuronas maduras.
   1. Encuentre células diferenciadas de las iPSC humanas mediante la visualización de tdTomato utilizando un microscopio confocal vertical equipado con una lente de inmersión en agua de 60X (0,9 NA).
   2. Tire de la pipeta registradora hasta una resistencia de 4 a 6 M. Perfunda las células a temperatura ambiente en una solución externa burbujeada constantemente con 95% O₂/ 5% CO₂. Llene la micropipeta de grabación con la solución interna.
   3. Conecte la celda tdTomato+ en modo de celda completa y registre el potencial de acción de disparo en respuesta a la inyección de corriente (duración de 1 segundo, incrementos de 10 pA) en la pinza amperimétrica.
2. Confirmar si el potencial de acción de las células corticales que expresan ChR2 es evocado de forma fiable por la estimulación lumínica.
   1. Encuentre células corticales que expresan ChR2 mediante la visualización de GFP bajo un microscopio confocal. Realice el registro de pinza de parche de celda completa en células corticales siguiendo los pasos 1.1.2 a 1.1.3.
   2. Compruebe que el potencial de acción se evoca de forma fiable mediante la iluminación luminosa con una lámpara de arco de mercurio (100 W). La longitud de onda del filtro de excitación es de 480/40 nm.
3. Realizar estimulación optogenética.
   1. Conecte la celda tdTomato+ en modo de celda completa y ajuste la pinza de voltaje a -70 mV. Filtre las señales de corriente a 2 kHz y digitalice a 10 kHz. Supervise las resistencias de la serie que van de 10 a 20 M para garantizar la consistencia durante las grabaciones.
   2. Estimule todo el campo con una lámpara de mercurio de 100 W con un filtro de excitación de 480/40 nm durante 30 segundos.
   3. Registre las corrientes postsinápticas (PSC) de las células parcheadas inducidas por la fotoestimulación de las neuronas corticales presinápticas que expresan ChR2. Detecte y mida las PSC.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaCl	sigma	S7653
Kcl	sigma	P5405
NaHCO3	sigma	S5761
NaH2PO4	Fluka	71505
MgCl2	sigma	M8266
CaCl2	sigma	C1016
D(+)-Glucosa	sigma	G7520	Para estudios electrofisiológicos
K-gluconato	sigma	Página 1847
Koh	KANTO Químico	3234400
HEPES	sigma	H3375	Para estudios electrofisiológicos
EGTA	sigma	E3889
Na2ATP	sigma	A7699
Na3GTP	sigma	G8877
Capilares de vidrio de borosilicato	Instrumentos de precisión mundial, Inc	1604323
Lámpara de arco corto de mercurio	OSRAM	HBO 103 W/2