Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

Resumen

perfil de expresión de ARN de regiones discretas del cerebro de ratón requiere una estrategia de recolección de tejido precisa y repetible. A continuación se describe un protocolo que utiliza tanto la sección coronal del cerebro como la microdisección asistida por un desgarrador de tejidos. El rendimiento y la calidad del ARN total obtenido de las muestras resultantes confirman la utilidad del método descrito.

Resumen

Como plataformas tecnológicas, enfoques como la secuenciación de próxima generación, el microarray y la qRT-PCR son muy prometedores para ampliar nuestra comprensión de la amplitud de la regulación molecular. Los enfoques más nuevos, como la secuenciación de ARN de alta resolución (RNA-Seq)¹, proporcionan información nueva y amplia sobre la expresión específica del tejido o del estado, como los niveles de transcripción relativos, el empalme alternativo y los micro ARN^2-4. Las perspectivas de emplear el método RNA-Seq en el perfil comparativo del transcriptoma completo⁵ dentro de tejidos discretos o entre grupos fenotípicamente distintos de individuos ofrecen nuevas vías para dilucidar los mecanismos moleculares implicados en estados fisiológicos normales y anormales. Recientemente, se ha realizado un perfil del transcriptoma completo en tejido cerebral humano, identificando diferencias en la expresión génica asociadas con la progresión de la enfermedad⁶. Sin embargo, el uso de la secuenciación de nueva generación aún no se ha integrado más ampliamente en los estudios con mamíferos.

Los estudios de expresión génica en modelos de ratón han reportado perfiles distintos dentro de varios núcleos cerebrales utilizando microscopía de captura láser (LCM) para la escisión de muestras^7,8. Si bien LCM permite la recolección de muestras con precisión de una sola célula y de regiones cerebrales discretas, los rendimientos relativamente bajos de ARN total del enfoque LCM pueden ser prohibitivos para RNA-Seq y otros enfoques de perfiles en tejidos cerebrales de ratones y pueden requerir pasos de amplificación de muestras subóptimos. Aquí, se presenta un protocolo para la microdisección y la extracción de ARN total de regiones discretas del cerebro de ratón. Los núcleos de tejido de diámetro establecido se utilizan para aislar 13 tejidos de secciones coronales seriadas de 750 μm de un cerebro de ratón individual. Las muestras de tejido micropunch se congelan y archivan inmediatamente. El ARN total se obtiene de las muestras utilizando la tecnología de aislamiento de ARN total habilitada para perlas magnéticas. Las muestras de ARN resultantes tienen un rendimiento y una calidad adecuados para su uso en el perfil de expresión posterior. Esta estrategia de microdisección proporciona una opción viable a las estrategias de recolección de muestras existentes para obtener ARN total de regiones cerebrales discretas, lo que abre posibilidades para nuevos descubrimientos de expresión génica.

Protocolo

1. Configuración y preparación de muestras

1. Complemente la solución salina equilibrada de Earle (EBSS) con bicarbonato de sodio (0,44 g por 100 mL de EBSS) y glucosa (0,884 g por 100 mL de EBSS)⁹. Trate el EBSS con DEPC (0,1 ml por 100 ml de EBSS) durante al menos 12 horas a 37 °C en un frasco o matraz esterilizable en autoclave con tapón de rosca.
2. Coloque pipetas Pasteur de vidrio de 5 3/4" en un vaso de precipitados de vidrio de 1000 ml y coloque pinceles de artista, con las cerdas hacia arriba, en un cilindro graduado de vidrio de 100 ml. Añada suficiente solución de DEPC (0,1 mL por 100 mL ddH₂O) para cubrir las pipetas y los cepillos, respectivamente. Cubra el vaso de precipitados y el cilindro graduado con papel de aluminio e incube durante al menos 12 horas a 37 °C.
3. Después de 12 horas de incubación con DEPC, caliente todos los materiales tratados con DEPC a una temperatura >100 °C durante al menos 15 minutos. Retire el EBSS y enfríe a temperatura ambiente antes del almacenamiento a 4 °C. Vierta ddH₂O lejos del vaso de precipitados y del cilindro graduado; continúe incubando a >100 °C hasta que los materiales estén secos. Retirar, enfriar a temperatura ambiente y guardar para uso posterior.
4. El día del experimento, trate todas las superficies de trabajo con RNaseZap.
5. Coloque y mantenga el EBSS en un baño de agua a 40 °C. Para amortiguar y oxigenar el EBSS, infílclelo con un 95%/5% de O₂/CO₂ colocando un tubo de gas en una pipeta Pasteur sin RNasa e insertando la pipeta en el EBSS. Cubra la abertura del contenedor EBSS.
6. Configure un cortador de tejido Stoelting para usar en la sección en serie del tejido cerebral. Trate las superficies superior e inferior de la cortadora de pañuelos con RNaseZap. Coloque un trozo rectangular de papel de filtro Whatman #4 en la superficie de plexiglás de la picadora de pañuelos. Coloque una hoja de afeitar de doble filo en el brazo picador. Ponga el micrómetro a cero y ajuste la altura mínima del brazo picador para permitir que la hoja de afeitar corte el papel de filtro, pero no la placa de plexiglás.
7. Reúna todos los materiales adicionales necesarios para la microdisección, incluidas las placas de cultivo celular de 60 x 15 mm sin ARNasa, los descorazonadores de tejidos Harris Uni-Core, las puntas de micropipeta sin ARNasa de 200 μL para fijar a los tubos de gas para la oxigenación por EBSS de las secciones cerebrales coronales durante la perforación de micromuestras, las tijeras curvas, el hielo seco y los tubos para la recolección de tejidos. Coloque los tubos sobre hielo seco.

2. Extirpación del cerebro y seccionamiento coronal

1. Coloca al ratón en un DecapiCone y decapitalo con una guillotina para roedores. Retire la cabeza del DecapiCone y colóquela sobre una superficie plana. Con un bisturí, corte la piel a lo largo de la línea media del cráneo comenzando aproximadamente 3 mm caudal hasta la fosa nasal. Retire lateralmente los colgajos de piel hacia atrás para exponer el cráneo y las cuencas de los ojos.
2. Con unas tijeras curvas, corte ambos nervios ópticos, cortando su conexión con el ojo. Abrir la cavidad craneal rompiendo cuidadosamente los huesos occipital e interparietal y extirpando los huesos dorsales parietal y frontal. Con un rongeur de hueso, rompa los huesos nasales y lagrimales para exponer los bulbos olfativos. Use tijeras curvas para cortar los bulbos olfativos del cerebro rostral. Extirpa todo el cerebro con el cerebro posterior intacto. Coloque el cerebro en la parte superior de una placa de cultivo de células Cellstar de 60 x 15 mm sin ARNasa. Transfiera a la superficie de trabajo de muestreo de tejidos.
3. Utilice una pipeta sin RNasa para humedecer de forma conservadora el papel de filtro en el picador de pañuelos adjunto con EBSS. Humedece el tejido cerebral con EBSS.
4. Transfiera el cerebro al cortador de tejidos y establezca la orientación adecuada. Nota: El cerebro debe colocarse con la superficie ventral apoyada en el papel de filtro. La línea media (fisura interhemisférica) debe ser perpendicular a la cuchilla del picador, y el borde rostral del cerebro debe colindar con la cuchilla.
5. Use un pincel de artista tratado con DEPC para mantener el cerebro inmóvil aplicando una presión suave en la superficie dorsal del cerebro. Mientras mantiene el cerebro inmóvil, levante la palanca del soporte de la cuchilla unos 4-5 cm por encima de la superficie del tejido dorsal y manténgala en esta posición. Retire el cepillo de la superficie del cerebro y marque 750 μm con el micrómetro. Deje que la palanca caiga, cortando el tejido y creando una sección coronal de 750 μm.
6. Mientras la cuchilla picadora permanece inmóvil, use un movimiento giratorio con el pincel de artista para deslizar suavemente la sección de tejido lejos de la superficie de la hoja. Coloque inmediatamente la sección de tejido en el EBSS oxigenado en la placa de Petri. Un segundo investigador puede comenzar en el paso 3.1.
7. Repita los pasos 2.5 y 2.6 hasta que se hayan obtenido secciones cerebrales en serie en todo el plano rostro-caudal.

3. Microdisección de la región encefálica

1. Ajuste la iluminación para garantizar que la iluminación de la muestra no se obstruya durante la microdisección de tejidos. Ajuste la posición y el flujo de la mezcla de 95%/5% de_O2/_CO2 para mantener un entorno amortiguado y oxigenado para el tejido durante la microdisección.
2. Identifique la sección coronal del cerebro que incluye la región de interés. Orienta la sección del cerebro en la parte inferior de la placa de Petri con un pincel de artista. Seleccione el descorazonador de tejidos con el diámetro adecuado según la Tabla 1 u otras referencias. Mientras sostienes la sección de tejido coronal en su lugar con el pincel del artista, lleva la punta de corte del descorazonador de tejido hacia abajo sobre la superficie de la sección de tejido.
3. Mientras aplica presión, presione la punta del descorazonador de tejido a través de la sección de tejido y hacia abajo firmemente sobre el fondo de la placa de Petri. Utilice un movimiento circular rodante para asegurarse de que la región de interés se ha disociado del tejido circundante. Levante con cuidado el descorazonador de tejido de la sección de tejido y libere el micropunzón, permitiendo que flote en el EBSS.
4. Con un pincel de artista, deposite inmediatamente el micropunzón de papel tisú en un tubo de almacenamiento estable a -80 °C mantenido sobre hielo seco. El tejido debe adherirse fácilmente al costado del tubo. Regrese el tubo que contiene la micromuestra al hielo seco.
5. Repita los pasos 3.2 a 3.4 para cada región del cerebro de interés.

4. Archivo de tejidos

1. Una vez completada la microdisección, utilice el sistema de escáner VisionMate para registrar los códigos de barras respectivos de cada tubo TrakMates que contenga muestra. Una vez que se haya llenado la gradilla de tubos TrakMates de 96 ranuras, escanee rápidamente la gradilla y coloque inmediatamente las muestras de tejido en un congelador a -80 °C hasta la extracción del ARN.

5. Extracción total de ARN

1. Prepare un espacio de trabajo libre de RNasa mediante RNaseZap. Prepare una cantidad suficiente de mezcla de perlas magnéticas y solución de lisis/unión como se describe en el Protocolo de aislamiento de ARN total MagMAX-96¹⁰.
2. Retire las muestras de tejido del congelador a -80 °C y coloque los tubos directamente sobre hielo seco.
3. Añada 100 μL de la solución de lisis/unión a un tubo TrakMates que contenga una muestra. Coloque un mortero del tamaño de un tubo de 0,5 ml sin nucleasas en el mezclador de pellets y homogeneice el tejido. Con una punta de pipeta sin nucleasas de baja retención, transfiera la muestra homogeneizada a un pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo redondo. Añada inmediatamente 60 μL de isopropanol al 100% a la muestra utilizando una punta de pipeta sin nucleasas de baja retención, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3-4 veces.
4. Añada 20 μL de la mezcla de perlas a la muestra utilizando una punta de pipeta sin nucleasa de baja retención. Mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 3-4 veces.
5. Repita los pasos 5.3-5.4 para todas las muestras de tejido.
6. Siga los pasos del protocolo de aislamiento de ARN total de MagMAX-96 a partir de III.A.2 para completar la extracción de ARN total. nota: Otros kits de aislamiento de ARN total habilitados para perlas magnéticas están disponibles comercialmente; sin embargo, no fueron examinados en este estudio. Consulte los manuales del kit del fabricante para obtener los detalles del aislamiento total de ARN utilizando los productos respectivos.
7. Mida la pureza y la concentración del ARN total resultante utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 3300 u otras tecnologías de espectrofotómetro/fluorómetro de pequeño volumen.

6. Resultados representativos:

Región/Núcleo Cerebral	Diámetro del descorazonador de tejidos (mm)	ARN total (ng/μL)	Relación 260/280
Corteza frontal	2.0	27.03	1.99
Núcleo Accumbens	1.0	6.26	2.77
Estriado	1.5	27.94	2.19
Corteza cingulada	1.5	29.05	2.07
Hipotálamo - Núcleo Paraventricular / Núcleo Supraquiasmático (PVN/SCN)	2.0	40.34	2.03
tálamo	2.0	34.40	2.00
Hipotálamo - Núcleo Dorsomedial / Núcleo Ventromedial (DMH/VMH)	2.0	44.83	2.05
amígdala	1.0	10.06	1.89
Hipocampo - Ca 2/3	1.5	7.31	2.32
Hipocampo - Ca1/Giro dentado	1.5	5.20	2.24
Gris Periacueductal	1.0	48.21	2.02
Núcleo dorsal del rafe	1.0	6.56	2.18
Formación reticular	2.0	35.35	2.27

Tabla 1. Enumeración de regiones cerebrales de ratón microdisecadas con respectivos diámetros óptimos de sacanúcleos de tejidos, rendimiento representativo de ARN total y pureza. Las 13 regiones cerebrales microdisecadas, enumeradas en orden rostro-caudal, varían en tamaño y orientación. El micropunch PVN/SCN incluye el núcleo paraventricular anteromedial, partes del núcleo periventricular, la zona subparaventricular y otras neuronas parvocelulares. El micropunch del tálamo incluye núcleos talámicos anteriores situados en el mismo plano coronal que la región del micropunch PVN/SCN. El micropunch DMH/VMH incluye núcleos magnocelulares accesorios y otras neuronas parvocelulares situadas entre el núcleo dorsomedial y el núcleo ventromedial. La muestra de amígdala incluye tanto la subregión central como la basolateral. El rendimiento de ARN y las proporciones 260/280 son valores únicos obtenidos de las muestras de microdisección respectivas para demostrar las lecturas obtenidas de cada región del cerebro.

Discusión

Hay muchos pasos críticos en este protocolo que merecen una cuidadosa atención y consideración. Se debe determinar la selección del diámetro apropiado del núcleo tisular para eliminar cada región de interés respectiva. Si bien los diámetros del núcleo de tejido presentados en la Tabla 1 son adecuados para la recolección de las regiones cerebrales enumeradas, cada investigador debe determinar el núcleo de tejido del tamaño apropiado para una recolección óptima de sus respectivos tejidos de interés. En segundo lugar, se...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Baño de agua Isotemp 102	Fisher Scientific	15-460-3Q
RNase Zap	Ambion	AM9782
Rotador de laboratorio (agitador orbital)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314 –- 1CEQ
Mezclador de pellets	VWR international	47747-370
Mortero de 0,5 ml sin RNasa	VWR international	KT749521-0590
Pirocarbonato de dietilo sin nucleasas (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758-50ML
Hojas de afeitar de doble filo	Stoelting Co.	51427
St– Cortadora de tejidos lting con micrómetro manual	Stoelting Co.	51425
2/0 Artista redondo' s pincel	Princeton Art Brush	4350R
Harris Uni-Core descorazonador de tejidos (0,75 mm)	Ted Pella, Inc.	15072
Perforador de tejidos Harris Uni-Core (1,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15099
Perforador de tejidos Harris Uni-Core (1,5 mm)	Ted Pella, Inc.	15075
Sacanúcleos de tejidos Harris Uni-Core (2,0 mm)	Ted Pella, Inc.	15076
Guillotina	Braintree Scientific, Inc.	RG-100
DecapiCones	Braintree Scientific, Inc.	MDC-200
HyClone Earle' s solución salina equilibrada (EBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30029.02
Pipetas de 25 mL	Corning	4489
Ep.I.P.S sin nucleasas. Puntas de pipeta LoRetention Dualfilter, 20 — 300 μ L	Eppendorf	0030 077.636
Tubos de rosca TrakMates con tapones Thermo	Fisher Scientific, Inc.	3741
Lector de código de barras inalámbrico 2D VisionMate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3122MTX
VisionMate SR lector de código de barras 2D de un solo bastidor	Thermo Fisher Scientific, Inc.	3115
1-200 μ L puntas de pipeta de ajuste universal	Corning	4864	Placas de
cultivo celular Cellstar	nucleasas	Greiner Bio-One	628160
cultivo de tejidos Greiner Bio-One de poliestireno de 96 pocillos Greiner Bio-One sin nucleasas, U-bottom	USA Scientific, Inc.	5665-0180	Papel de filtro sin nucleasas
#4	Whatman, GE Healthcare	1004 150
Relleno de pipetas de seguridad tipo bombilla de silicona	Fisher Scientific	13-681-102A
NanoDrop 3300 Espectrofotómetro	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-3300