El perfilado de la expresión de ARN en regiones cerebrales discretas del ratón requiere una estrategia precisa y reproducible de recolección de tejido. Aquí se describe un protocolo que utiliza tanto la sección coronal del cerebro como la microdisección asistida por punzón tisular. El rendimiento y la calidad del ARN total obtenido a partir de las muestras resultantes confirman la utilidad del método descrito.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica
En este artículo
Resumen
Resumen
Como plataformas tecnológicas, enfoques como la secuenciación de nueva generación, los microarreglos y la qRT-PCR tienen un gran potencial para ampliar nuestra comprensión sobre la amplitud de la regulación molecular. Enfoques más recientes, como la secuenciación de ARN de alta resolución (RNA-Seq)1, proporcionan información nueva y amplia sobre la expresión específica de tejidos o estados, tales como niveles relativos de transcritos, empalme alternativo y microARNs2-4. Las perspectivas de emplear el método de RNA-Seq en perfiles comparativos del transcriptoma completo5 dentro de tejidos discretos o entre grupos de individuos fenotípicamente distintos ofrecen nuevas vías para elucidar los mecanismos moleculares implicados en estados fisiológicos tanto normales como anormales. Recientemente, se ha realizado el perfilado del transcriptoma completo en tejido cerebral humano, identificando diferencias en la expresión génica asociadas con la progresión de enfermedades6. Sin embargo, el uso de la secuenciación de nueva generación aún no se ha integrado más ampliamente en estudios con mamíferos.
Los estudios de expresión génica en modelos de ratón han reportado perfiles distintos dentro de diversos núcleos cerebrales mediante el uso de microdisección láser (LCM) para la escisión de muestras7,8. Aunque la LCM permite la recolección de muestras con precisión a nivel de célula individual y de regiones cerebrales discretas, los rendimientos relativamente bajos de ARN total obtenidos mediante este método pueden limitar el uso de ARN-Seq y otros enfoques de perfilado en tejidos cerebrales de ratón, y podrían requerir pasos de amplificación de muestras subóptimos. Aquí se presenta un protocolo para la microdisección y extracción de ARN total a partir de regiones cerebrales discretas de ratón. Se utilizan punzones de tejido de diámetro fijo para aislar 13 tejidos a partir de secciones coronales seriadas de 750 μm de un cerebro individual de ratón. Las muestras obtenidas mediante micropunción tisular se congelan inmediatamente y se archivan. El ARN total se obtiene de las muestras mediante tecnología de aislamiento de ARN total basada en perlas magnéticas. Las muestras de ARN resultantes presentan un rendimiento y calidad adecuados para su uso en perfilado de expresión posterior. Esta estrategia de microdisección proporciona una alternativa viable frente a las estrategias existentes de recolección de muestras para obtener ARN total a partir de regiones cerebrales discretas, abriendo posibilidades para nuevos descubrimientos en expresión génica.
Protocolo
1. Configuración y preparación del muestreo
- Suplemente la solución salina balanceada de Earle (EBSS) con bicarbonato de sodio (0,44 g por cada 100 mL de EBSS) y glucosa (0,884 g por cada 100 mL de EBSS)9. Trate la EBSS con DEPC (0,1 mL por cada 100 mL de EBSS) durante al menos 12 horas a 37 °C en un frasco o botella autoclavable con tapa roscada.
- Coloque 5 pipetas Pasteur de vidrio de 5 ¾" en un vaso de precipitados de vidrio de 1000 mL, y coloque pinceles de artista con las cerdas hacia arriba en un cilindro graduado de vidrio de 100 mL. Añada suficiente solución de DEPC (0,1 mL por cada 100 mL de ddH2O) para cubrir las pipetas y los pinceles, respectivamente. Cubra el vaso de precipitados y el cilindro graduado con papel de aluminio e incube durante al menos 12 horas a 37 °C.
- Tras la incubación de 12 horas con DEPC, caliente todos los materiales tratados con DEPC a una temperatura >100 °C durante al menos 15 minutos. Retire la EBSS y enfríe a temperatura ambiente antes de almacenarla a 4 °C. Vierta el ddH2O lejos del vaso de precipitados y del cilindro graduado; continúe la incubación a >100 °C hasta que los materiales estén secos. Retírelos, enfríe a temperatura ambiente y almacénelos para su uso posterior.
- El día del experimento, trate todas las superficies de trabajo con RNaseZap.
- Coloque y mantenga la EBSS en un baño de agua ajustado a 40 °C. Para tamponar y oxigenar la EBSS, infíltrelo con O2/CO2 al 95%/5% introduciendo un tubo de gas en una pipeta Pasteur libre de RNasas e insertando la pipeta en la EBSS. Tape la abertura del recipiente de EBSS.
- Prepare un cortador de tejidos Stoelting para su uso en el corte seriado del tejido cerebral. Trate las superficies superior e inferior del cortador de tejidos con RNaseZap. Fije un trozo rectangular de papel filtro Whatman n.º 4 a la superficie de plexiglás del cortador de tejidos. Fije una cuchilla de doble filo al brazo del cortador. Ajuste el micrómetro a cero y regule la altura mínima del brazo del cortador para que la cuchilla corte el papel filtro, pero no la placa de plexiglás.
- Reúna todos los materiales adicionales necesarios para la microdisección, incluyendo placas de cultivo celular RNasa-libres de 60x15 mm, sacabocados Harris Uni-Core, puntas de micropipeta RNasa-libres de 200 μL para fijar al tubo de gas para la oxigenación de cortes coronales cerebrales en EBSS durante el muestreo por perforación, tijeras curvas, hielo seco y tubos para la recolección del tejido. Coloque los tubos sobre hielo seco.
2. Extracción del cerebro y sección coronal
- Coloque el ratón en un DecapiCone y decápitelo utilizando una guillotina para roedores. Retire la cabeza del DecapiCone y colóquela sobre una superficie plana. Con un bisturí, corte la piel a lo largo de la línea media del cráneo, comenzando aproximadamente 3 mm caudal a la nariz. Retire lateralmente los colgajos de piel para exponer el cráneo y las órbitas oculares.
- Utilizando tijeras curvas, corte ambos nervios ópticos, seccionando su conexión con el ojo. Abra la cavidad craneal rompiendo cuidadosamente los huesos occipital e interparietal y retirando los huesos parietales dorsales y frontal. Con un rongeur óseo, rompa los huesos nasales y lagrimales para exponer los bulbos olfativos. Use tijeras curvas para separar los bulbos olfativos del cerebro rostral. Retire todo el cerebro manteniendo intacto el cerebelo. Coloque el cerebro en la parte superior de una placa de cultivo celular Cellstar de 60 x 15 mm, libre de RNasas. Transfiera a la superficie de trabajo para muestreo de tejido.
- Utilice una pipeta libre de RNasas para humedecer moderadamente el papel filtro adherido al cortador de tejidos con EBSS. Humedezca el tejido cerebral con EBSS.
- Transfiera el cerebro al cortador de tejidos y colóquelo en la orientación adecuada. Nota: El cerebro debe colocarse con la superficie ventral apoyada sobre el papel filtro. La línea media (fisura interhemisférica) debe quedar perpendicular a la cuchilla del cortador, y el borde rostral del cerebro debe quedar adyacente a la cuchilla.
- Utilice un pincel de artista tratado con DEPC para mantener el cerebro inmóvil ejerciendo una ligera presión sobre la superficie dorsal del cerebro. Mientras mantiene el cerebro fijo, levante la palanca del soporte de la cuchilla unos 4-5 cm por encima de la superficie dorsal del tejido y manténgala en esta posición. Retire el pincel de la superficie del cerebro y gire el micrómetro a 750 μm. Suelte la palanca, cortando así el tejido y generando una sección coronal de 750 μm.
- Mientras la cuchilla del cortador permanece inmóvil, use un movimiento de rodado con el pincel para deslizar suavemente la sección de tejido lejos de la superficie de la cuchilla. Coloque inmediatamente la sección de tejido en el EBSS oxigenado dentro de la placa de Petri. Un segundo investigador puede comenzar con el paso 3.1.
- Repita los pasos 2.5 y 2.6 hasta obtener secciones cerebrales seriadas a lo largo de todo el plano rostro-caudal.
3. Microdisección de regiones cerebrales
- Ajuste la iluminación para asegurar que la iluminación de la muestra no se vea obstaculizada durante la microdisección del tejido. Ajuste la posición y el flujo de la mezcla 95%/5% de O2/CO2 para mantener un entorno tamponado y oxigenado para el tejido durante la microdisección.
- Identifique la sección coronal del cerebro que incluya la región de interés. Oriente la sección cerebral plana sobre el fondo de la placa de Petri utilizando un pincel de artista. Seleccione el sacabocados de tejido con el diámetro adecuado según la Tabla 1 u otras referencias. Mientras sostiene la sección de tejido coronal en su lugar con el pincel, acerque la punta cortante del sacabocados sobre la superficie de la sección de tejido.
- Mientras aplica presión, presione la punta del sacabocados a través de la sección de tejido y hacia abajo firmemente sobre el fondo de la placa de Petri. Utilice un movimiento circular rodante para asegurar que la región de interés haya sido disociada del tejido circundante. Levante cuidadosamente el sacabocados de la sección de tejido y libere el micropunch, permitiéndole flotar en el EBSS.
- Utilizando un pincel de artista, coloque inmediatamente el micropunch de tejido en un tubo de almacenamiento estable a -80 °C mantenido sobre hielo seco. El tejido debe adherirse fácilmente a la pared del tubo. Devuelva el tubo que contiene la micro-muestra al hielo seco.
- Repita los pasos 3.2 a 3.4 para cada región cerebral de interés.
4. Archivado de tejidos
- Una vez completada la microdisección, utilice el sistema de escáner VisionMate para registrar los códigos de barras correspondientes de cada tubo TrakMates que contenga muestras. Una vez que se haya llenado el soporte de tubos TrakMates de 96 posiciones, escanee rápidamente el soporte y coloque inmediatamente las muestras de tejido en un congelador a -80 °C hasta la extracción de ARN.
5. Extracción de ARN total
- Prepare un espacio de trabajo libre de RNasas utilizando RNaseZap. Prepare una cantidad suficiente de mezcla de perlas magnéticas y solución de lisis/unión según se describe en el Protocolo de Aislamiento de ARN Total MagMAX-9610.
- Saque las muestras de tejido del congelador a -80 °C y coloque los tubos directamente sobre hielo seco.
- Agregue 100 μL de la solución de lisis/unión a un tubo TrakMates que contenga la muestra. Fije un pistilo nuclease-free de tamaño 0.5 ml a la mezcladora de pellets y homogenice el tejido. Utilizando una punta de pipeta nuclease-free de baja retención, transfiera la muestra homogeneizada a un pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos con fondo redondeado. Inmediatamente agregue 60 μL de isopropanol al 100 % a la muestra usando una punta de pipeta nuclease-free de baja retención y mezcle aspirando y expulsando 3-4 veces.
- Agregue 20 μL de la mezcla de perlas a la muestra utilizando una punta de pipeta nuclease-free de baja retención. Mezcle aspirando y expulsando 3-4 veces.
- Repita los pasos 5.3-5.4 para todas las muestras de tejido.
- Siga los pasos del Protocolo de Aislamiento de ARN Total MagMAX-96 a partir del punto III.A.2 para completar la extracción de ARN total. NOTA: Otros kits comerciales de aislamiento de ARN total basados en perlas magnéticas están disponibles; sin embargo, no fueron evaluados en este estudio. Consulte los manuales del fabricante para obtener detalles sobre el aislamiento de ARN total utilizando los productos respectivos.
- Mida la pureza y concentración del ARN total obtenido utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 3300 u otras tecnologías de espectrofotómetro/fluorómetro de pequeño volumen.
6. Resultados representativos:
| Región cerebral/Núcleo | Diámetro del sacabocados de tejido (mm) | ARN total (ng/μL) | Relación 260/280 |
| Corteza frontal | 2.0 | 27.03 | 1.99 |
| Núcleo accumbens | 1.0 | 6.26 | 2.77 |
| Estriado | 1.5 | 27.94 | 2.19 |
| Corteza cingulada | 1.5 | 29.05 | 2.07 |
| Hipotálamo - Núcleo paraventricular / Núcleo supraquiasmático (PVN/SCN) | 2.0 | 40.34 | 2.03 |
| Tálamo | 2.0 | 34.40 | 2.00 |
| Hipotálamo - Núcleo dorsomedial / Núcleo ventromedial (DMH/VMH) | 2.0 | 44.83 | 2.05 |
| Amígdala | 1.0 | 10.06 | 1.89 |
| Hipocampo - CA 2/3 | 1.5 | 7.31 | 2.32 |
| Hipocampo - CA1/Giro dentado | 1.5 | 5.20 | 2.24 |
| Griseo periacueductal | 1.0 | 48.21 | 2.02 |
| Núcleo del rafe dorsal | 1.0 | 6.56 | 2.18 |
| Formación reticular | 2.0 | 35.35 | 2.27 |
Tabla 1. Enumeración de regiones cerebrales de ratón microdiseccionadas con sus respectivos diámetros óptimos del sacabocados de tejido, rendimiento total representativo de ARN y pureza. Las 13 regiones cerebrales microdiseccionadas, enumeradas en orden rostro-caudal, varían en tamaño y orientación. El microperforado de PVN/SCN incluye el núcleo paraventricular anteromedial, porciones del núcleo periventricular, la zona subparaventricular y otras neuronas parvocelulares. El microperforado del tálamo incluye núcleos talámicos anteriores situados en el mismo plano coronal que la región del microperforado PVN/SCN. El microperforado DMH/VMH incluye núcleos magnocelulares accesorios y otras neuronas parvocelulares situadas entre el núcleo dorsomedial y el núcleo ventromedial. La muestra de amígdala incluye tanto las subregiones central como basolateral. El rendimiento de ARN y las relaciones 260/280 son valores individuales obtenidos de muestras respectivas de microdisección para demostrar las lecturas obtenidas de cada región cerebral.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Existen muchos pasos críticos en este protocolo que requieren atención y consideración cuidadosas. La selección del diámetro adecuado del sacabocados de tejido debe determinarse para extraer cada región de interés respectiva. Aunque los diámetros de sacabocados de tejido presentados en la Tabla 1 son adecuados para la recolección de las regiones cerebrales indicadas, cada investigador debe determinar el tamaño apropiado del sacabocados para lograr una recolección óptima de sus tejidos de interés respectivos. En segundo l...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No se declararon conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA) y la Oficina de Investigación del Ejército (Army Research Office, ARO), número de concesión W911NF-10-1-006.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Baño de agua Isotemp 102 | Fisher Scientific | 15-460-3Q | |
| RNase Zap | Ambion | AM9782 | |
| Rotador de laboratorio (agitatador orbital) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314 –- 1CEQ | |
| Mezclador de pellet | VWR international | 47747-370 | |
| Pestillo de 0,5 mL libre de RNasa | VWR international | KT749521-0590 | Libre de nucleasas |
| Pirocarbonato de dietilo (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-50ML | |
| Cuchillas de afeitar de doble filo | Stoelting Co. | 51427 | |
| St–Cortador de tejidos con micrómetro manual | Stoelting Co. | 51425 | |
| Artista de aguja redonda 2/0’s cepillo | Pincel de arte Princeton | 4350R | |
| Harris Uni-Core sacabocados de tejido (0,75 mm) | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Harris Uni-Core sacabocados de tejido (1,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15099 | |
| Harris Uni-Core sacabocados de tejido (1,5 mm) | Ted Pella, Inc. | 15075 | |
| Harris Uni-Core sacabocados de tejido (2,0 mm) | Ted Pella, Inc. | 15076 | |
| Guillotina | Braintree Scientific, Inc. | RG-100 | |
| Decapiconos | Braintree Scientific, Inc. | MDC-200 | |
| HyClone Earle’una solución equilibrada de sales (EBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30029.02 | |
| Pipetas de 25 mL | Corning | 4489 | Libre de nucleasas |
| epT.I.P.S. puntas de pipeta LoRetention Dualfilter, 20 — 300 μL | Eppendorf | 0030 077.636 | |
| Tubos TrakMates con tapa roscada y tapones | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3741 | |
| Lector inalámbrico de códigos de barras 2D VisionMate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3122MTX | |
| Lector de códigos de barras 2D VisionMate SR de estante individual | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3115 | |
| 1-200 μPuntas de pipeta de ajuste universal | Corning | 4864 | Libre de nucleasas |
| Placas de cultivo Cellstar | Greiner Bio-One | 628160 | Libre de nucleasas |
| Placa de cultivo celular Greiner Bio-One de 96 pocillos de poliestireno, tipo Cellstar, fondo redondo (U) | USA Scientific, Inc. | 5665-0180 | Libre de nucleasas |
| #4 Papel de filtro | Whatman, GE Healthcare | 1004 150 | |
| Aspirador de pipetas de seguridad tipo bulbo de silicona | Fisher Scientific | 13-681-102A | |
| Espectrofotómetro NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
Referencias
- Pickrell, J. K. Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing. Nature. 464, 768-772 (2010).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).
- Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).
- Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. MicroRNAs: small RNAs with big effects. Transplantation. 90, 105-112 (2010).
- Forrest, A. R., Carninci, P. Whole genome transcriptome analysis. RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).
- Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease. PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).
- Paulsen, S. J. Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays. J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).
- Winrow, C. J. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N. Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits. PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).
- Technologies, L. MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual. , Forthcoming.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
