Imágenes de la señalización de calcio inducida por nicotina a lo largo de los axones del hipocampo ventral en cocultivos sinápticos

Resumen

Fuente: Zhong, C., et al., Imágenes en vivo de la señalización de calcio inducida por nicotina y la liberación de neurotransmisores a lo largo de los axones del hipocampo ventral. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra cómo la activación mediada por nicotina de los receptores nicotínicos de acetilcolina en el hipocampo ventral del ratón da como resultado una señalización sostenida de calcio a lo largo de los axones.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Imágenes de calcio

1. Enjuague los cultivos (5 a 7 días in vitro) rápidamente con HBS normal, luego cargue los cultivos con 5 μM de indicador Fluo-4 Ca²⁺ (AM ester) y 0,02% de Pluronic F-127 en HBS (2 ml) durante 30 min a 37 °C y 5% de CO₂.
2. Lave la solución Fluo-4 con HBS (3 veces/5 min). Vuelva a colocar los cultivos en la incubadora (37 °C / 5% CO₂) durante al menos 30 min.
3. Mantener los cultivos (5 a 7 días in vitro) en una cámara de imagen y montar la cámara en un microscopio confocal de disco giratorio. Perfundir continuamente (1 ml/min) con cóctel HBS en RT.
4. Recoja imágenes de fluorescencia Fluo-4 de las proyecciones axonales de los microcortes de vHipp con un objetivo Plan-Apochromat (60X agua con 1,4 NA, excitación 488 nm, emisión 530 nm) y una cámara CCD.
5. Recopile imágenes de fluorescencia Fluo-4 de referencia (cada 10 segundos durante 2 minutos) como control previo a la nicotina. Aplicar nicotina (1 μM) por perfusión rápida (2 ml/min) durante 1 min, luego lavar la nicotina con un cóctel HBS. Siga capturando imágenes de lapso de tiempo antes, durante y después de la aplicación de nicotina cada 10 segundos durante 30 minutos.
6. Guarde todos los fotogramas de las imágenes de fluorescencia fluorescente-4 sin procesar y expórtelos como una serie de imágenes TIFF para su posterior análisis.
7. Recoja la intensidad integrada de la fluorescencia fluo-4 a lo largo de los axones vHipp antes y después de la aplicación de nicotina.
8. Normalice la intensidad de fluorescencia integrada con la siguiente ecuación: ΔF/F₀ = (F-F₀)/F₀, donde F₀ es la intensidad de fluorescencia integrada previa a la nicotina corregida en el fondo, y F es la intensidad de fluorescencia integrada a lo largo de los axones vHipp en cada punto de tiempo después de la aplicación de nicotina. Analice y trace la intensidad de fluorescencia integrada normalizada.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cóctel HBS para imágenes en vivo pH = 7.3
NaCl	sigma	S9888	135 mM
Kcl	sigma	P9333	5 mM
Cloruro de magnesio	sigma	M8266	1 mM
Cloruro de calcio	sigma	C1016	2 mM
HEPES	sigma	H3375	10 mM
glucosa	sigma	G0350500	10 mM
Tetrodotoxina	Tocris	Año 1078	2 μM
Bicucullina	Tocris	Artículo 131	10 μM
D-AP-5	Tocris	Artículo 105	50 μM
CNQX	Tocris	Artículo 1045	20 μM
LY341495	Tocris	Año 1209	10 μM