Prueba de la función nerviosa sensorial en un modelo de ratón denervado quirúrgicamente

Abstract

Fuente: Peterson, S. C. et al., Denervación quirúrgica cutánea: un método para probar el requisito de nervios en modelos de ratón de enfermedad de la piel. J. Vis. Exp. (2016)

Este video muestra cómo probar la función de los nervios sensoriales en un modelo de ratón denervando quirúrgicamente un lado y dejando el otro como control. La respuesta a la estimulación mecánica confirma el papel de los nervios sensoriales.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Denervación quirúrgica

1. Inyectar la solución anestésica por vía intraperitoneal a una dosis de 200 μl por cada 20 g de peso corporal del ratón. Comprobar que el animal ha alcanzado el plano adecuado de sedación mediante la prueba de pinzamiento de los dedos del pie, y confirmar que las frecuencias cardíaca y respiratoria son normales (aproximadamente 600 latidos y 160 respiraciones por minuto, respectivamente).
2. Prepare el área quirúrgica de la piel de la espalda con toallitas Betadine y alcohol, y cubra al animal con un paño quirúrgico estéril (para fines de demostración, se omitió el paño estéril para aumentar la visibilidad) Mantenga al animal caliente con una almohadilla térmica mientras opera en un área quirúrgica aséptica.
3. Haz una incisión con un bisturí estéril #11 a lo largo de la línea media dorsal desde la base del cuello hasta aproximadamente 0,5 cm por encima de la cola.
4. Con pinzas romas, refleje suavemente la piel del lado izquierdo, lejos del flanco, para visualizar el tejido subyacente desde las almohadillas de grasa escapular cerca del cuello hasta justo por encima >nota: Los nervios cutáneos dorsales aparecen como hebras blancas que viajan caudalmente a través de la fascia translúcida de la pared del tronco antes de hacer curvas cerradas y entrar en el tejido conectivo suelto debajo de la piel (Figura 1).
5. Usando pinzas ultrafinas bajo un microscopio óptico de disección, extraiga los nervios exclusivamente del lado izquierdo del animal ubicado en los sitios anatómicos T3-12 arrancando desde donde los segmentos se doblan en la pared del tronco hasta sus sitios de entrada en la piel (Figura 1).
   1. Orient fórceps verticalmente y extirpa los nervios agarrándolos aproximadamente 0,5 cm por debajo de sus sitios de flexión y tirando hacia arriba, lo que hace que el nervio se estire y se separe del tejido circundante (Figura 1C-E). Tenga cuidado de evitar romper los vasos sanguíneos adyacentes.
   2. Continúe hasta que se extirpen todos los nervios que se extienden desde la pared del tronco hasta la piel. No altere los nervios dentro de la fascia densa de la pared del tronco. Mantenga el tejido húmedo durante todo el procedimiento aplicando periódicamente gotas de solución salina estéril al 0,9 %.
   3. Alternativamente, extirpe los nervios agarrando sus extremos proximales cerca de la pared del tronco con pinzas y cortando con tijeras finas. Después, corte los extremos distales cerca de la piel (Figuras 1F-H). Por último, retire los segmentos nerviosos intermedios (Figura 1I).
6. Retire los nervios del colgajo de piel expuesto en el paso 1.4. Estas fibras comprenden las ramas distales de los nervios cutáneos dorsales y aparecen como hebras ramificadas blancas ubicadas esporádicamente dentro del tejido conectivo en el lado dérmico del colgajo cutáneo (Figuras 1J-K).
   1. Para eliminar estas ramas finas, coloque las pinzas finas aproximadamente paralelas a la superficie dérmica, agarre los nervios y arranque hacia arriba para evitar romper los vasos sanguíneos y perforar la piel. Continúe hasta que se hayan extirpado todos los nervios visibles.
7. Usando una disección roma, refleje la piel en el lado derecho de la incisión de la línea media dorsal, pero no extirpe los nervios. Esto servirá como el control contralateral operado simuladamente.
8. Sutura a lo largo de la línea media dorsal en un patrón interrumpido simple para cerrar la incisión usando suturas de nailon 6-0, en un patrón interrumpido simple espaciado aproximadamente 3 mm entre sí.
9. No devuelva los ratones que se han sometido a una cirugía a la misma jaula que otros animales hasta después de la recuperación completa.
10. Monitoree a los animales inmediatamente después de la cirugía hasta que recuperen la conciencia, y también diariamente hasta que el área quirúrgica haya sanado, generalmente dentro de 1 semana. Use analgésicos de acuerdo con las pautas institucionales designadas para el cuidado y uso de animales si los ratones muestran signos de dolor o angustia. Retire las suturas dentro de los 7 a 10 días posteriores a la cirugía. nota: Si es necesario, prepare la solución analgésica diluyendo carprofeno (50 mg/ml de solución madre) 1:100 en agua estéril. Inyecte la solución por vía subcutánea entre los omóplatos cerca del pescuezo, a una dosis de 200 μl por cada 20 g de peso corporal (5 mg/kg de peso corporal del ratón).
11. Para evaluar funcionalmente la denervación estable hasta varias semanas después de la cirugía, retire el vello de la piel dorsal con una maquinilla eléctrica.
12. Pinche suavemente el área de la piel denervada con una aguja hipodérmica y observe si el animal responde, generalmente estremeciéndose o girando la cabeza. Si el área de la piel se ha denervado de manera estable, el animal mostrará poca o ninguna respuesta.

Results

Figura 1. Dos enfoques para denervar la piel dorsal. (A) Diagrama de dibujos animados de piel de ratón inervada. Las líneas punteadas rojas indican una sola escisión realizada a lo largo de la línea media dorsal para exponer la musculatura subyacente en la pared del tronco (púrpura), así como la dermis (gris, asterisco) debajo de la piel reflejada. Los nervios cutáneos dorsales que viajan caudalme...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Almohadillas de preparación para bebidas alcohólicas	Pdi	B339
AnaSed (xilacina)	Lloyd	NADA 139-236
Almohadillas de preparación Betadine	Medline	MDS093917
Carprofeno (Rimadyl)	Zoetis
Cortapelos inalámbrico recargable	Wahl	Recortadora modelo 8900
Suturas de nylon 6-0	DemeTECH	NL166012F4P
Pinzas ultrafinas	Dumont	0103-5-PO