Investigación del potencial de residuo despolarizante prolongado (PDA) en fotorreceptores de Drosophila

Resumen

Fuente: Gutorov, R., et al. Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en los fotorreceptores de Drosophila. J. Vis. Exp. (2022).

Este video muestra un protocolo experimental para investigar el potencial de residuo despolarizante prolongado (PDA) en Drosophila de ojos blancos. El ojo de la mosca se expone a pulsos de luz azul intensos para convertir el fotopigmento rodopsina en metarodopsina, iniciando una cascada de señalización que abre canales iónicos positivos y provoca la despolarización de la membrana. Debido a que la luz azul impide la reconversión de la metarodopsina en rodopsina, la afluencia continua de iones positivos da como resultado una despolarización sostenida, conocida como potencial de reposición de despolarización prolongada (PDA).

Protocolo

1. Medición del potencial de resimisión despolarizante prolongado (PDA) mediante el electrorretinograma

1. Condiciones de cría adecuadas para la preparación de Drosophila melanogaster
   1. Criar moscas D. melanogaster en botellas que contienen maíz amarillo estándar que contienen alimento en una incubadora mantenida a una temperatura de 24 °C y en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h.
   2. Mantenga los frascos de moscas en la oscuridad al menos 24 horas antes del experimento.
2. Configuración general
   1. Prepare las pipetas de grabación tirando de capilares de vidrio de borosilicato rellenos de fibra de 1 mm x 0,58 mm (diámetro exterior x diámetro interior) (Figura 1L, O). La resistencia de las pipetas debe ser de 5-10 MΩ; Se puede utilizar cualquier tirador adecuado.
   2. Cubra dos cables de plata con AgCl₂, insertando un cable de plata de 0,25 mm en una solución de KCl de 3 M conectada a una fuente de alimentación de 5 V hecha a medida.
   3. Inserte cada alambre de plata recubierto en los portaelectrodos (Figura 1N).
   4. Llene el capilar de vidrio con solución de Ringer filtrada (ver Tabla 1) usando una jeringa de punta alargada (Figura 1M).
   5. Inserte el electrodo de alambre en el capilar de vidrio. Asegúrese de que la solución dentro del capilar esté en contacto con el alambre de plata.
   6. Inserte los portaelectrodos (Figura 2P, N) en los dos micromanipuladores de electrodos (Figura 2G).
3. Procedimiento de preparación de la mosca para registros eléctricos
   NOTA: Para mantener la mosca en condiciones adaptadas a la oscuridad, use solo una iluminación de luz roja tenue durante los siguientes pasos.
   1. Anestesiar las moscas en la botella con gas CO₂ usando el sistema de traviesas de moscas (Figura 1A, B) y verterlas en el recipiente de traviesas.
   2. Elija una mosca y sujétela con cuidado por su ala con una pinza afilada. Cubre el resto de las moscas con una placa de Petri.
   3. Coloque la mosca en el soporte para moscas en la orientación adecuada, acostado de lado, con la espalda hacia la mano (Figura 1P).
   4. Encienda la fuente de alimentación del soldador. Ajuste la corriente a ~2.25 A. Esta corriente debería calentar el filamento de platino-iridio de 0,25 mm a ~55-56 °C.
   5. Coloque una gota de cera a baja temperatura de fusión (~55-56 °C) sobre el soldador (Figura 1F).
   6. Con unas pinzas, levante la mosca de sus alas y fíjela al soporte de la mosca (Figura 1I) con el soldador.
   7. Usando el soldador, conecte la espalda de la mosca a la superficie del soporte con cera (Figura 1P).
   8. Baje la punta del soldador sobre el punto de unión de las patas y derrita la cera para cubrir todas las patas juntas (Figura 1P).
   9. Coloque una pequeña gota de cera entre la cabeza y la espalda en el área del cuello (Figura 1P).
      NOTA: Tenga especial cuidado para evitar el sobrecalentamiento de la cabeza de mosca. Asegúrese de que la mosca esté correctamente fijada y no pueda moverse durante el experimento; Los movimientos menores pueden crear artefactos en las grabaciones. Asegúrese de que las aberturas de la tráquea (entradas de respiración) en el tórax y el abdomen no estén cubiertas con cera.
   10. Coloque el soporte para moscas (Figura 2Q) en una jaula oscura de Faraday en un bloque magnético (Figura 2I) y asegúrese de que la mosca esté a ~5 mm del extremo de la guía de luz (Figura 2L).
   11. Coloque el electrodo de registro (Figura 2P) sobre el ojo de la mosca y el electrodo de tierra (Figura 2N) sobre la parte superior de la espalda de la mosca utilizando los micromanipuladores.
   12. Inserte el electrodo de tierra en la parte posterior de la mosca usando los micromanipuladores.
   13. Inserte el electrodo de registro en la periferia externa del ojo de la mosca, preferiblemente, utilizando micromanipuladores.
       nota: Después de insertar el electrodo en el ojo, se observará un pequeño hoyuelo; Tire del electrodo hacia arriba sin quitarlo del ojo hasta que desaparezca el hoyuelo. Los electrodos también se pueden sumergir en pequeñas gotas de gelatina de electrodos aplicada en el torso y el ojo.
4. Protocolo PDA (este protocolo solo se puede realizar en moscas de ojos blancos)
   1. Dé un pulso de luz de 5 s de intensidad máxima utilizando un filtro naranja (filtro de borde 590, para convertir el fotopigmento máximo al estado R).
   2. Reemplace el filtro naranja por un filtro azul de banda ancha (BP450/40 nm) y dé tres pulsos de luz de 5 s a máxima intensidad.
      NOTA: También es posible dar un pulso de luz azul de intensidad máxima continua y larga hasta que se alcance una respuesta de voltaje de estado estacionario.
   3. Espere 60 s en la oscuridad, reemplace el filtro azul con el filtro naranja anterior y dé dos pulsos de luz de 5 s con intervalos de 60 s.

Tabla 1: Composición de la solución de Ringer

La solución de Ringer
Reactivo	Concentración (mM)
NaCl	130
Kcl	número arábigo
MgCl2	5
CaCl2	número arábigo
HEPES	10
Valoración del pH a 7,15 utilizando NaOH y HCl

Resultados

Figura 1: Herramientas y dispositivos necesarios para la fijación de moscas y la preparación de la pipeta de registro. (A) Sistema de traviesas de mosca; (B) Pedal del sistema de traviesas de mosca; (C) Fuente de luz fría; D) Microscopio estereoscópico; (E) Calentador de filamento de cera; F) Soldador; (G) Pedal calentador de filamento de cera; (H) Pinzas ásperas; (I) Soporte magnético para moscas; (...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 1 ml con punta alargada			Figura 1M
1 pinza áspera		Dumont #5, Estándar	0,1 mm x 0,06 mm, longitud 110 mm, acero inoxidable (Figura 1H)
2 lentes de condensador
Convertidor A/D	Dispositivo molecular	Digidata 1200	Posible sustitución: cualquier digidata de dispositivos moleculares (p. ej., 1440A) - Figura 2C
amplificador	Electrónica casi perfecta		Posible reemplazo: Instrumentos Warner- IE251A o IE-210 (viene con cabecera)- Figura 2D
Mesa antivibratoria	Newport	VW-3036-OPT-01	Figura 7H
Capilares	Aparato de Harvard	Capilares de vidrio de borosilicato	1 mm x 0,58 mm (Figura 1O)
Clampex	Dispositivo molecular		software
Depósito de CO2
Fuente de luz fría	Schott	KL1500 LCD	Figura 1C
Limpiaparabrisas delicados	Kimtech		Toallitas Kimwipes (Figura 1K)
Portaelectrodo			Adecuado para diámetro exterior capilar de 1 mm (Figura 1N, Figura 2N y Figura 2P)
Jaula de Faraday	Hecho en casa		Blindaje electromagnético contra el ruido y cortina frontal negra (Figura 2K)
Filtro (color)	Schott	OG590, Filtro de borde	Figura 2S
Filtro (color)	Schott	BP450/40 nm	Figura 2S
Filtro (color)	Chaquetas	550 nm	Figura 2S
Filtro (color) para fuente de luz fría	Schott	RG630	Figura 1C
Filtro (calor)	Schott	KG3	Figura 1S
Filtros (Filtro de densidad neutra)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figura 2S
Sistema de lámpara de flash	Honeywell		Figura 2U
Sistema de traviesas con inyector	Inyectar + matic		Figura 1A-B
Fuente de alimentación de la lámpara	Pti	LPS-220	Figura 2W
Detector de luz	Hecho en casa		Fototransistor (Figura 2O)
Guía de luz			3 mm de diámetro, 1,3 m de largo (Figura 2L,M)
Fuente de luz			Lámpara de xenón de 75 W sin ozono de alta presión (que funciona con 50 W), posible reemplazo: Cairn research- OptoLED (Figura 7R)
Cera derretida a baja temperatura	Hecho en casa		Compuesto por una mezcla de cera de abejas (Tm≈62 °C) y parafina a ~3:1 para alcanzar una temperatura de fusión de ~55-56 °C (Figura 6J)
Soporte magnético para moscas	Hecho en casa		Figura 1I y Figura 2Q
Sistema de preamplificador de microelectrodos con etapa de cabeza	Electrónica casi perfecta		Probador de impedancia (Figura 2G)
Micromanipulador (mecánico grueso)	Investigación Tritech, Narishige	M-2
Micromanipulador (mecánico fino)	Microsistemas Leitz	Micromanipulador mecánico Leitz	Figura 2F
pCLAMP	Dispositivo molecular		software
placa de Petri			60 milímetros
Generador de pulsos	AMPI	Maestro 8	Figura 2A
Crema Redux para electrocardiografía	Laboratorios Parker	Redux Crema de electrolitos
Controlador del obturador	Uniblitz, Vincent Asociados	VCM-D1 Monocanal Uniestable	Figura 2V
Sistema de persianas	Uniblitz, Vincent Asociados	LS2 2 mm Obturadores Uni-estables	Figura 2V
Alambre de plata	Instrumentos Warner		0,25–1 mm de diámetro, necesita clorado
Soldador compuesto por un filamento de platino-iridio			0,25 mm de diámetro (Figura 2F)
Microscopio estereoscópico con zoom	Nikon	SMZ-2B	Figura 1D
Microscopio estereoscópico con zoom	salvaje	M5 salvaje	Con ajustes de aumento de 6, 12, 25 y 50 aumentos (Figura 2E)
Filtros de jeringa	Millex		Filtro de PVDF de 22 μm
Extractor de pipetas vertical	Sutter/ Narishige	Modelo P-97/PP-830	Utilice un extractor vertical u horizontal, según se prefiera (Figura 1L)
Calentador de filamento de cera	Hecho en casa		Figura 1E-G
Sistema de lámpara de destello de xenón	Dr. Rapp OptoElectrónico	JML-C2	Figura 2X