Visualización y mapeo de vías neuronales en un corte de cerebro de amígdala

Abstract

Fuente: Bosch, D., et al. Disección Optogenética Ex Vivo de Circuitos de Miedo en Cortes de Cerebro. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra un procedimiento para analizar la conectividad sináptica entre la corteza prefrontal medial (mPFC) y las neuronas de la amígdala utilizando cortes de cerebro de amígdala aguda de ratones. Las neuronas mPFC de estos ratones expresan canalrodopsina fusionada con una proteína fluorescente. Las canalrodopsinas facilitan la entrada de iones y la generación de potencial de acción en las neuronas mPFC tras la activación de la luz. En consecuencia, las neuronas mPFC liberan neurotransmisores que se unen a las neuronas de la amígdala postsináptica, desencadenando corrientes postsinápticas que se registran para visualizar la conectividad mPFC-amígdala.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Visualización y estimulación de las fibras presinápticas

1. Preparar el microscopio de parche para la activación optogenética de fibras y células:
   1. Centre el diodo emisor de luz (LED) montado en la vía de suministro de luz.
   2. Mida la intensidad de la luz LED en el plano focal posterior y en la salida de cada objetivo con un medidor de potencia eligiendo la longitud de onda adecuada de 470 nm.
   3. Calcule la intensidad de la luz en mW/^mm2 y cree una curva de calibración (intensidad del LED (%) frente a la salida de luz (mW/mm²)) para cada objetivo para los valores medidos para una longitud de onda de 470 nm.
2. Recupere un corte de amígdala aguda de la cámara de interfaz y colóquelo en la cámara de corte montado en el microscopio vertical equipado con una lámpara fluorescente. Tenga cuidado de colocar el corte de manera que la superficie del corte hacia arriba en la cámara de interfaz también esté orientada hacia arriba en la cámara de grabación. Perfundir el corte con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado (ACSF) fresco a una velocidad de 1 a 2 ml/min a una temperatura de ~31 °C.
3. Observe las fibras presinápticas en el corte utilizando la lámpara fluorescente en combinación con conjuntos de filtros apropiados para la proteína fluorescente específica expresada. Utilice el objetivo 5x para obtener una visión general (Figura 1E) y el objetivo 60x para la evaluación de la densidad de fibra dentro del área objetivo.
   Nota: Para GFP e YFP, use el juego de filtros "verde" (Excitación 472/20, Divisor de haz 495, Emisión 490 LP) para mCherry use el juego de filtros "rojo" (Excitación 560/40, Divisor de haz 585, Emisión 630/70) como se especifica en la tabla de materiales / equipos.
4. Abra o restrinja la apertura en la vía de luz del microscopio según lo desee para el experimento (Figura 2D).
5. Para obtener un registro de parches, llene una pipeta de parche con solución interna y móntela en el soporte de electrodos. Aplique presión positiva a la pipeta de parche y bájela lentamente, primero en la solución de baño y luego, bajo control visual, en el corte con el micromanipulador.
   1. Acérquese a la neurona de interés con la pipeta de parche desde el lateral y la parte superior. Libere la presión positiva cuando la pipeta esté en la superficie de la célula (hoyuelo visible en la superficie de la célula) y obtenga un "gigaseal" aplicando presión negativa.
   2. Aplique más succión para romper el parche de membrana y obtener el registro de toda la célula. Posteriormente, estimule las fibras marcadas con el LED conectado utilizando la longitud de onda adecuada para activar la canalrodopsina (ChR) (470 nm) mientras registra las respuestas eléctricas de la celda.
   3. Para la estimulación sináptica, comience con una intensidad de LED baja y aumente hasta alcanzar la amplitud de corriente sináptica deseada. Active el LED configurando las salidas digitales en el software de adquisición de datos para controlar la temporización y la longitud del pulso (ejemplos en la Figura 3).
      Nota: se puede utilizar otro software y/o dispositivos generadores de TTL para disparar el LED.
6. Repita la estimulación con apertura abierta o restringida (paso 1.4) en la vía de luz del microscopio según se desee para la siguiente célula registrada y/o en presencia de fármacos específicos.

Results

Figura 1. Inyecciones estereotácticas, preparación de cortes agudos de cerebro y visualización de fibras presinápticas. (A, B) Inyección estereotáctica de virus. A) Imagen de un ratón anestesiado colocado en un marco estereotáctico con el cráneo expuesto y la pipeta de inyección. Recuadro: Amplíe la imagen de la pipeta de inyección llena de solución de virus mezclada con verde rápido...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, por sus siglas en inglés)	Para la composición ver referencias #16 y #23
Soluciones de parches internos	Para la composición ver referencias #16 y #23
MagnesioSulfato Heptahidratado	Roth, Alemania	P027.1	preparar la solución madre de 2M en agua purificada
Estereoscopio, SZX2-RFA16	Olimpo, Japón
Lámpara fluorescente Xcite (XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group, Canadá	2012-12699
Microscopio de parche, BX51WI	Olimpo, Japón
Amplificador de parche Multiclamp 700B	Dispositivos moleculares, EE. UU.
Digitdata 1440A	Dispositivos moleculares, EE. UU.
Software PClamp, versión 10	Dispositivos moleculares, EE. UU.		Se utiliza para controlar la adquisición de datos y la estimulación
Regulador de temperatura de baño, TC05	Luigs & Neumann, Alemania	200-100 500 0145
Micromanipulador de tres ejes Mini 25	Luigs & Neumann, Alemania	210-100 000 0010
Controlador de micromanipulador SM7	Luigs & Neumann, Alemania	200-100 900 7311
Capilares de vidrio para pipetas de parche	World Precision Instruments, Alemania	GB150F-8P
Papel de filtro de nitrato de celulosa para cámara de interfaz	Satorius Stedim Biotech, Alemania	13006--50----ACN
Unidad LED, CoolLED pE	CoolLED, Reino Unido	244-1400	CoolLED o USL 70/470 y los adaptadores adecuados son dos opciones alternativas para la estimulación LED
CoolLED 100 Doble Adaptación	CoolLED, Reino Unido	ADAPTADOR pE-50E
Unidad LED, USL 70/470	Rapp Optoelectrónica	L70-000
Adaptador de doble puerto	Rapp Optoelectrónica	Consultar con la empresa
Juego de filtros rojo (excitación)	AHF, Alemania	F49-560	Los filtros se pueden comprar como juego F46-008
(divisor de haz)	AHF, Alemania	F48-585
(emisión)	AHF, Alemania	F47-630
Juego de filtros verde (excitación)	AHF, Alemania	F39-472	Alternativas: juego de filtros F36-149 o F46-002 (con emisión de paso de banda)
(divisor de haz)	AHF, Alemania	F43-495W
(emisión)	AHF, Alemania	F76-490
LaserCheck, medidor de potencia portátil	Coherent, Estados Unidos	1098293
Software IgorPro, versión 6	Wavemetrics, Estados Unidos		Para el análisis de datos de electrofisiología, también se pueden utilizar otros paquetes de software alternativos
Suite de macros Neuromatic para IgorPro	http://www.neuromatic.thinkrandom.com