Registro del electrorretinograma y del potencial evocado visual en una rata

Resumen

Fuente: Charng, J. et al. Implantación y registro de electrorretinograma inalámbrico y potencial evocado visual en ratas conscientes. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra cómo registrar el electrorretinograma (ERG) y el potencial evocado visual (VEP) en una rata consciente. La rata, con electrodos implantados quirúrgicamente, se adapta primero a la oscuridad. Después de aplicar las gotas dilatadoras, el animal se coloca en un sujetador y se coloca en un recipiente Ganzfeld. A continuación, se registran las señales ERG y VEP.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de electrodos

>Nota: Se utiliza un transmisor de tres canales para la implantación quirúrgica, lo que permite realizar simultáneamente 2 registros de electrorretinograma (ERG) y 1 de potencial evocado visual (VEP). Los tres electrodos activos y los tres inactivos deben colocarse previamente en forma de anillo antes de la implantación para que se adhieran al ojo. Para fines de identificación, el fabricante ha encerrado los electrodos activos en fundas de plástico mitad blancas y mitad coloreadas, mientras que los electrodos inactivos están cubiertos con fundas de color completo. El electrodo de tierra (funda de plástico transparente) se deja inalterado para que todos los electrodos activos e inactivos realicen los pasos 1.1, 1.2, 1.3 y 1.7.

1. Desenrolle el electrodo de acero inoxidable de doble hebra con dos alicates de punta fina.
2. Recorte una de las hebras de acero inoxidable (aproximadamente a 1 cm de la punta), dejando una sola hebra recta más larga para dar forma al electrodo anular.
3. Dobla la hebra de acero inoxidable sobre sí misma y gírala, formando un anillo suave en la punta del electrodo.
4. Para los electrodos activos ERG, forme este bucle ~ 0,2 - 0,5 mm de diámetro girando la base del bucle (para el propósito descrito aquí, forme dos electrodos activos de esta manera para registrar ERG desde ambos ojos), y para los electrodos ERG inactivos y VEP, haga que el diámetro del bucle sea ~ 0,8 mm de diámetro (en este ejemplo, haga esto para un electrodo VEP activo y los tres electrodos inactivos).
5. Enganche el electrodo activo VEP circular alrededor de un tornillo de acero inoxidable (diámetro 0,7 mm, longitud 3 mm) de modo que el electrodo descanse contra la cabeza del tornillo.
6. Enganche los 3 electrodos inactivos (2 ERG, 1 VEP) alrededor de un segundo tornillo de acero inoxidable (diámetro 0,7 mm, longitud 3 mm).
7. Tire de la funda de plástico hacia adelante sobre los extremos afilados de las dos hebras de acero inoxidable para reducir la irritación.
8. Esterilice los transmisores de telemetría sumergiéndolos en glutaraldehído al 2% durante más de 10 horas a aproximadamente 25 °C. Luego, enjuague el transmisor con solución salina estéril tres veces.

>2. Implantación del transmisor

1. Preparación Animal
   1. Desinfectar el área quirúrgica antes de la experimentación limpiándola con etanol al 70%. Esterilizar en autoclave todo el equipo quirúrgico antes de usarlo y mantener el equipo en clorhexidina cuando no esté en uso durante la cirugía. Cubra al animal con un paño quirúrgico durante la cirugía para mantener un ambiente estéril. Asegúrese de que todos los experimentadores usen mascarillas quirúrgicas, guantes estériles y batas.
   2. Inducir la anestesia con isoflurano al 1,5 - 2% a un caudal de 3 L/min y mantenerla al 1,5 - 2 % a 2 L/min durante toda la cirugía. Confirme la profundidad suficiente de la anestesia por la ausencia de un reflejo pedal al pellizcar el músculo entre los dedos de los pies.
   3. Afeita un área de 40 mm x 30 mm sobre el abdomen desde arriba de la ingle hasta el esternón.
   4. Afeita un área de 30 mm x 20 mm sobre la frente, posterior a los ojos y anterior a las orejas.
   5. Desinfecte las dos áreas afeitadas. Para la zona de la frente desinfectar con povidona yodada al 10% tres veces (evitar el uso de antisépticos a base de alcohol para la zona cercana a los ojos, siendo coherentes con la Norma de Práctica establecida por la Asociación de Tecnólogos Quirúrgicos). Sobre el abdomen, desinfectar con un 10% de povidona yodada y un 70% de etanol.
   6. Aplique 1 gota de proxymetacaína en la córnea para anestesia tópica adicional.
   7. Aplique 1 gota de carboximetilcelulosa sódica en la córnea para evitar la sequedad de los ojos.
2. Implantación quirúrgica
   1. Realice una incisión de 10 mm en la cabeza a lo largo de la línea media vertical entre las orejas con un bisturí quirúrgico.
   2. Haga una incisión de 5 mm en el abdomen a través de la capa de piel a lo largo de la línea media debajo del esternón.
   3. Tunelizar una cánula de 5 mm de diámetro por vía subcutánea desde la incisión del abdomen hasta la incisión de la cabeza.
   4. Alimente los cables de los electrodos (3 activos y 3 inactivos) del transmisor a través de la cánula desde el abdomen hasta la cabeza.
   5. Deje el electrodo de referencia con la base del transmisor y cubra la punta del electrodo con una gasa aséptica.
   6. Cubra las puntas de los electrodos (3 activos y 3 inactivos) con una gasa aséptica.
   7. Asegura la cabeza de la rata a una plataforma estereotáxica.
   8. Extienda la incisión de la frente a 30 mm de largo con unas tijeras quirúrgicas.
   9. Exponga el área quirúrgica retrayendo la piel suelta con 2 suturas (3 - 0) a las ~ 3 y 9 en punto.
   10. Raspe el periostio que recubre el cráneo con una gasa esterilizada para exponer las suturas de bregma, lambda y línea media.
   11. Taladre dos orificios a través del cráneo en las coordenadas estereotáxicas VEP activa (7 mm ventral a bregma, 3 mm lateral a la línea media) e inactiva (5 mm rostral a bregma en la línea media).
   12. Fije los electrodos activos e inactivos VEP con tornillos de acero inoxidable preinstalados (diámetro 0,7 mm, longitud 3 mm) al cráneo con un destornillador pequeño a ~ 1 mm de profundidad en los orificios prefabricados. Esto ancla el tornillo al hueso sin dañar el tejido cortical subyacente.
   13. Para implantar los electrodos activos ERG, utilice una sutura 8 - 0 para retraer temporalmente el párpado superior.
   14. Insertar una cánula de 16 a 21 G por vía subcutánea desde detrás del ojo hasta el fórnix conjuntival superior.
   15. Retire la aguja guía.
   16. Pase el electrodo activo a través del catéter de plástico acortado desde la frente hacia el ojo. Luego, retire el catéter de plástico.
   17. Utilice una sutura temporal (8 - 0), que se introduce a través del bucle del electrodo, para evitar que el electrodo se retraiga de nuevo en el túnel.
   18. Realice una incisión de 0,5 mm en la conjuntiva superior a las 12 en punto, 1 mm detrás del limbo. Use la disección roma para exponer la esclerótica subyacente.
   19. Implante una sutura de 8 - 0 o 9 - 0 inmediatamente detrás del limbo con la mitad del grosor escleral.
   20. Retire la sutura temporal del electrodo activo ERG.
   21. Ancle el electrodo activo ERG a la sutura de medio espesor escleral atando 3 nudos consecutivos, asegurándose de que la punta del electrodo esté situada cerca del limbo.
   22. Cierre el colgajo conjuntival con 1 a 2 suturas interrumpidas (8 - 0 a 9 - 0). Asegúrese de que la conjuntiva cubra completamente el electrodo ERG para mejorar la comodidad.
   23. Retire la sutura retráctil del párpado.
   24. Repita el procedimiento para el ojo contralateral.
   25. Aplique gel de cianoacrilato sobre el cráneo para asegurar todos los tornillos de acero inoxidable y los cables de los electrodos. Asegúrese de que los electrodos activos ERG no estén demasiado apretados antes de asegurarlos para permitir los movimientos oculares.
   26. Cierre la herida en la cabeza con una sutura 3 - 0 no absorbible.
   27. Gire el roedor para exponer el área abdominal. Alargar la incisión dérmica abdominal a 40 mm a lo largo de la línea alba con unas tijeras quirúrgicas.
   28. Realice una incisión de 35 mm a través de la pared muscular interna para exponer la cavidad abdominal interna.
   29. Mediante dos suturas (3 - 0), el cuerpo transmisor se fija a la pared abdominal interna del lado derecho del animal. Evite entrar en contacto con el hígado.
   30. Enrolle el electrodo de tierra y asegúrelo en esta forma con una sutura (3 - 0). Luego, colócalo flotando libremente en la cavidad abdominal.
   31. Cierre el peritoneo con una sutura continua (3 - 0).
   32. Cierre la incisión cutánea con suturas interrumpidas (3 - 0).
3. Cuidados postoperatorios
   1. Vigile al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener el decúbito esternal. Aloja al animal individualmente después de la cirugía.
   2. Administrar carprofeno por vía subcutánea para la analgesia (5 mg/kg) una vez al día durante 4 días.
   3. Añadir antibióticos orales profilácticos (Enrofloxin, 5 mg/kg) al agua de bebida durante 7 días después de la cirugía.
   4. Aplique un ungüento antiinflamatorio en los sitios de incisión de la piel para reducir la irritación durante los primeros 7 días después de la cirugía.

>3. Realizar grabaciones ERG y VEP en ratas conscientes

1. Animal adaptado a la oscuridad durante 12 horas antes de las grabaciones ERG y VEP.
2. Realizar todas las manipulaciones experimentales bajo una iluminación roja tenue (17,4 cd.m-2, λmax = 600 nm)
3. Aplique anestesia tópica (0,5% de proxymetacaína) y gotas dilatadoras (0,5% de tropicamida) en la córnea.
4. Guíe al roedor consciente hacia un retenedor transparente hecho a medida.
   nota: La longitud de este tubo de plástico se puede ajustar para acomodar ratas de diferentes tamaños, con un diámetro total fijado en 60 mm. La parte delantera del dispositivo es cónica para minimizar el movimiento de la cabeza y contiene perforaciones para permitir la respiración normal. Este frente cónico permite la alineación y estabilización de la cabeza y los ojos de la rata con la abertura de la esfera de Ganzfeld. Tenga en cuenta que el roedor se ha aclimatado al sistema de retención (de 3 a 5 ocasiones) antes de la cirugía.
5. Coloque el roedor frente al cuenco de Ganzfeld con los ojos alineados con la abertura del cuenco.
6. Encienda el transmisor permanente pasando un imán a ~ 5 cm de él. Luego, verifique que el transmisor esté encendido verificando la luz de estado LED en la base del receptor.
7. Recoge señales en un rango de energías luminosas (es decir, de -5,6 a 1,52 log cd.s.m²).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bioamplificador	ADInstrumentos	ML 135	Amplifica las señales ERG y VEP
Carboximetilcelulosa sódica 1,0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Mantener la hidratación de la córnea durante la cirugía
Carprofeno 0,5%	Grupo de Salud Animal de Pfizer	CAS 53716-49-7	Analgesia postoperatoria, administrada con solución salina inyectable para la reposición de líquidos
Clorhexadina 0,5%	Laboratorios Orión	27411, 80085	Desinfección de instrumental quirúrgico
Activador de gel de cianoacrilato	Componentes RS	473-439	Seca rápidamente el gel de cianoacrilato
Gel de cianocrilato	Componentes RS	473-423	Fije los tornillos de acero inoxidable al cráneo
Fresa dental	Instrumentos Storz, Bausch y Lomb	E0824A	Cabeza de broca en miniatura de ~0,7 mm de diámetro para hacer un pequeño orificio en el cráneo sobre cada hemisferio para implantar tornillos VEP
perforar	Bosch	Serie Dremel 300	Taladro automático para trepanado
Enrofloxin	Laboratorios Troya		Antibiótico profiláctico post cirugía
Esfera integradora de Ganzfeld	Soluciones fotométricas internacionales		Estimulador de luz diseñado a medida: 36 mm de diámetro, tamaño de apertura de 13 cm
Hisopos de gasa	Productos Médicos Multigate Pty Ltd	57-100B	Seca la incisión quirúrgica y la superficie expuesta del cráneo durante la cirugía
Isoflurano 99,9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Nombre del propietario: Isoflo(TM) Anestésico inhalatorio. Anestésico inhalatorio de grado farmacéutico mezclado con gas oxígeno para la cirugía de implante de electrodos VEP
Ungüento de Kenacomb	Aspen Pharma Pty Ltd		Para reducir la irritación de la piel y la picazón después de la cirugía
LEDs Luxeon	Iluminación Phillips Co.		Para la estimulación lumínica, veinte LEDs de 5 vatios y uno de 1 vatio, controlados por el software Scope
Aguja (macrocirugía)	Instrumentos de precisión mundial	501959	para suturar cirugía abdominal y de cabeza, utilizado con sutura 3-0, aguja de ojo, borde cortante 5/16 círculo Tamaño 1, 15 mm
Portaagujas (macrocirugía)	Instrumentos de precisión mundial	500224	Para sujetar la aguja durante una cirugía abdominal y de cabeza
Portaagujas (microcirugía)	Instrumentos de precisión mundial	555419NT	Para sujetar la aguja durante la cirugía ocular
Catéter Optiva	Smiths Medical International Ltd	16 o 21 G	Guiar los electrodos activos de la córnea desde el cráneo hasta la conjuntiva
Povidona yodada 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Nombre del propietario: Betadine, Antiséptico para preparar la piel afeitada para la cirugía 10%, 500 mL
Sistema de adquisición de datos Powerlab	ADInstrumentos	ML 785	Adquiera la señal del transmisor de telemetría, emparejada con el convertidor de datos de telemetría
Proxymetacaína 0.5%	Laboratorios Alcon	CAS 5875-06-9	Analgesia ocular tópica
Restricción	Hecho de Cutom		La parte delantera del restricción es cónica para minimizar el movimiento de la cabeza, la longitud se puede ajustar para adaptarse a diferentes longitudes de ratas, el diámetro total es de 60 mm.
Hoja Scapel	R.G. Suministros Médicos	SNSM0206	Para incisión quirúrgica
Tijeras (macrocirugía)	Instrumentos de precisión mundial	501225	para cortar tejido en los abodmen y la frente
Tijeras (microcirugía)	Instrumentos de precisión mundial	501232	Para diseccionar la conjuntiva para la fijación de electrodos
Software de alcance	ADInstrumentos	Versión 3.7.6	Activa simultáneamente el estímulo a través del sistema ADI Powerlab y recopila datos
afeitadora	Oster	Dorado A5	Afeitar el pelo de las áreas quirúrgicas
Tornillos de acero inoxidable	MicroSujetadores	L001.003CS304	0,7 mm de diámetro del eje, 3 mm de longitud
Marco estereotáxico	David Kopf	Modelo 900	Instrumento estereotáxico de pequeño animal para localizar los puntos de referencia de implantación en el cráneo
Paño quirúrgico	Suministros médicos vitales	GM29-612EE	Garantizar un ambiente estéril durante la cirugía
Sutura (macrocirugía)	Agujas médicas Ninbo	3-0	Para suturar cirugía abdominal y de cabeza, trenzado de seda estéril, 60cm
Aguja de sutura (microcirugía)	Agujas médicas Ninbo	8-0 o 9-0	Para cirugía ocular que incluye, electrodo de sutura a la esclerótica y cierre de la herida conjuntival, sutura de nylon, círculo de 3/8 1×5, 30 cm
Convertidor de datos de telemetría	DataSciences International (en inglés)	R08	Permite que la señal de telemetría interactúe con el software de recopilación de datos
Matriz de intercambio de datos de telemetría	DataSciences International (en inglés)		Recopila datos de los transmisores, empareja con el receptor
Receptor de datos de telemetría	DataSciences International (en inglés)	RPC-1	Recibe datos de telemetría del transmisor
Transmisor de telemetría	DataSciences International (en inglés)	F50-EEE	Transmisor de telemetría de 3 canales
Tropicamida 0,5%	Laboratorios Alcon		Dilatación del iris
Pinzas (macrocirugía)	Instrumentos de precisión mundial	500092	Manipular tejidos durante una cirugía abdominal y de cabeza
Pinzas (microcirugía)	Instrumentos de precisión mundial	500342	Manipular tejidos durante la cirugía ocular