Registro electroencefalográfico de convulsiones epilépticas en ratas inducidas por epilepsia

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Montaje del dispositivo de electrodo de sonda de microdiálisis

1. Utilice un electrodo de dos trenzas de 3 canales (con una longitud de corte de al menos 20 mm del electrodo de registro y un electrodo de puesta a tierra de 10 cm de largo) y conéctelo a una cánula guía para preparar el dispositivo. Vea ejemplos de electrodos de 3 canales y cánula guía para diálisis en la Figura 1A-1B.
2. Retire (Figura 1C) e inserte (Figura 1D) la cánula guía metálica en la cánula de plástico ficticia varias veces antes de su uso para facilitar su extracción en el momento de su cambio para la sonda de microdiálisis en animales.
3. Doble los alambres retorcidos del electrodo de registro dos veces (Figura 1E-1F) para alinear los cables con la cánula ficticia de la guía y corte la punta del electrodo (Figura 1G) para que sea 0,5 mm más larga que la punta de la cánula guía (Figura 1H) usando el calibrador digital.
4. Tenga listo el anillo de silicona de 1 mm de largo (diámetro exterior [D.O.] 2 mm, espesor 0,3 mm; Figura 1I) e inserte la punta de la cánula guía y la punta de los electrodos retorcidos en el anillo de silicona con las pinzas (Figura 1J). Fijarlo al pie del pedestal de la cánula guía con cola polimérica de acción rápida o resina (Figura 1K). Vea el ejemplo de los dispositivos completados en la Figura 1L y la Figura 2A.
5. Esterilice el dispositivo bajo luz ultravioleta (UV) germicida durante 4 h. Gire el dispositivo cuatro veces para que cada uno de sus lados quede expuesto a la luz durante 1 h.
   nota: Muchos electrodos y sondas de microdiálisis caseros se pueden ensamblar de manera similar. La cabeza del implante para ratas descrito anteriormente tiene las siguientes dimensiones: 7 mm de ancho x 5 mm de profundidad x 10 mm de largo desde la parte superior hasta la punta del pedestal; La punta del implante mide unos 11 mm de largo, 600 μm de diámetro y todo el dispositivo pesa entre 330 y 360 mg. El dispositivo puede reutilizarse dos o tres veces si: i) se deja una longitud suficiente del electrodo de tierra en el cráneo durante la cirugía para el uso siguiente y ii) cuando se mata al animal y se recupera el dispositivo junto con el cemento dental, se deja en acetona durante la noche, de modo que el cemento pueda desagregarse mecánicamente, y el dispositivo se lavó y esterilizó de nuevo.

>2. Cirugía estereotáxica

1. Utilice un aparato estereotáxico y un soporte de clip de sonda (Figura 2B) para la implantación del dispositivo siguiendo los estándares contemporáneos para cirugías asépticas e indoloras.
   1. Anestesiar a las ratas Sprague-Dawley adultas con una mezcla de ketamina/xilacina (43 mg/kg y 7 mg/kg, por vía intraperitoneal [i.p.]) y fijarla en el marco estereotáxico. Añadir anestesia isoflurano (1,4% en aire; 1,2 mL/min) a la inyección inicial de ketamina/xilacina, ya que permite controlar la profundidad de la anestesia a tiempo. Afeita el pelaje de la cabeza del animal.
2. Frote la superficie de la piel de la cabeza con una solución a base de yodo seguida de etanol al 70% para prepararla para la cirugía aséptica.
   1. Implante el dispositivo de cánula-electrodo guía preparado en precedencia (1,1 – 1,5) en el hipocampo ventral derecho utilizando las siguientes coordenadas: barra nasal + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm a bregma. Siga las técnicas estándar para las cirugías estereotáxicas.
   2. Asegúrese de que no cubra los tornillos de anclaje. Al montarlo en el aparato estereotáxico, sujete el dispositivo para la cabeza de la cánula guía, ya que puede alinearse fácilmente con el soporte de la sonda.
3. Ancle el dispositivo al cráneo con al menos cuatro tornillos de acero inoxidable atornillados en el hueso del cráneo (1 tornillo en las placas óseas frontales izquierdas y 1 tornillo en las placas óseas frontales derechas, 1 tornillo en las placas óseas parietales izquierdas y 1 tornillo en las placas óseas interparietales). Añade una gota de pegamento para tejidos, para fijar aún más cada tornillo al hueso del cráneo.
   1. Cubra la mitad de las roscas de los tornillos con cemento metacrílico. Promover la unión del cemento haciendo surcos poco profundos en el hueso para aumentar la adherencia.
4. Una vez que la punta del dispositivo esté colocada en el tejido cerebral, gire el cable del electrodo de tierra alrededor de 3 tornillos de anclaje. Cubra todos los tornillos montados y el dispositivo con cemento dental.
5. Monitoree a los animales durante la cirugía y durante aproximadamente 1 hora después hasta que estén erguidos y moviéndose alrededor de la jaula. Manténgalos en una almohadilla térmica para evitar la hipotermia. Permita que las ratas se recuperen durante al menos 7 días después de la implantación del dispositivo.
6. Monitoree a los animales al menos una vez al día durante 3 días después de la cirugía para detectar signos de dolor o angustia. Administrar a los animales la crema antibiótica (gentamicina 0,1%) cerca de la zona incisa para prevenir la infección y un analgésico (tramadol 5 mg/kg, i.p.) durante 3 días para prevenir el dolor postquirúrgico.

>3. Inducción de epilepsia del lóbulo temporal por pilocarpina y asignación de animales a grupos experimentales

1. Después de una semana de recuperación postquirúrgica, asignar los animales aleatoriamente a los grupos: (i) animales control que recibirán vehículo y (ii) animales epilépticos que recibirán pilocarpina. Utilice un número proporcionalmente mayor de animales para el grupo epiléptico, ya que no todas las ratas a las que se les administró pilocarpina desarrollarán la enfermedad.
2. Inyectar una dosis de metilescopolamina (1 mg/kg, por vía subcutánea [s.c.]) y 30 min después, una inyección única de pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) para inducir el estado epiléptico (SE). Inyecte metilescopolamina y el vehículo (solución salina) a las ratas de control. Utilice una jeringa de 1 ml con aguja de 25G para todas las administraciones i.p.
   1. Comprobar visualmente que los animales empiecen a tener convulsiones conductuales (mover la vibrisa en 5 min, asentir con la cabeza, clonar las extremidades) y en 25 min clonar continuamente todo el cuerpo (SE).
3. Detener la EE 2 h después del inicio para tener una mortalidad de alrededor del 25% y un período de latencia promedio de aproximadamente 10 días por administración de diazepam (20 mg/kg, i.p.). Observe y registre cualquier comportamiento convulsivo que comience inmediatamente después de la inyección de pilocarpina y continúe durante al menos 6 horas a partir de entonces.
4. Administre a los animales solución salina (1 mL, i.p.) usando una jeringa de 1 mL con aguja de 25G y solución de sacarosa (1 mL, p.o.) usando una jeringa de 1 mL y una aguja de alimentación flexible de 17G durante 2-3 días después de la SE para promover la recuperación de la pérdida de peso corporal.
   1. Excluir del estudio a los animales que no alcancen el peso corporal inicial dentro de la primera semana después de la SE de pilocarpina (excepto para el grupo agudo sacrificado 24 h después de la EE, donde el seguimiento del peso corporal no es posible).
5. Asigne aleatoriamente a los animales post-EE a diferentes grupos experimentales (Figura 3): fase aguda (donde la microdiálisis tiene lugar 24 h después de la EE), latencia (7-9 días después de la EE), primera convulsión espontánea (aproximadamente 11 días después de la EE) y período crónico (comienza aproximadamente 22-24 días después de la EE, es decir, unos 10 días después de la primera convulsión). Vigile a los animales para detectar la aparición de convulsiones espontáneas.
   nota: Utilice los siguientes criterios de inclusión/exclusión para experimentos posteriores en ratas epilépticas: desarrollo de EE convulsiva dentro de 1 h después de la administración de pilocarpina; aumento de peso en la primera semana después de la SE y la correcta colocación de la sonda y el electrodo de microdiálisis.

>4. Monitoreo y análisis del comportamiento epiléptico

1. Seguimiento a largo plazo del comportamiento epiléptico
   1. Aproximadamente 6 horas después de la administración de pilocarpina (es decir, al final de la observación directa por parte de los investigadores), coloque a los animales en las jaulas limpias de la casa e inicie el monitoreo de video de 24 horas.
   2. Continuar con la videovigilancia de 24 h hasta el día 5, utilizando un sistema de videovigilancia digital.
   3. A partir del día 5, conecte las ratas en sus jaulas rectangulares domésticas al sistema de grabación de EEG atado y continúe con el monitoreo de video las 24 horas.
   4. Ajuste los parámetros en el amplificador colocado fuera de la jaula de Faraday (establezca el factor de amplificación en cada canal de acuerdo con la especificidad de la señal de EEG de cada animal) e inicie la adquisición de EEG observando la señal de EEG producida por cables no conectados. Utilice una frecuencia de muestreo de 200 Hz y un filtro de paso bajo ajustado a 0,5 Hz.
   5. Conecte el animal a los cables que sujetan la cabeza de un animal entre dos dedos estirados de una mano y atornille los conectores al pedestal del electrodo con la otra mano libre. Iniciar la adquisición.
      cautela: Asegúrese de que la señal esté libre de artefactos. Los artefactos comunes son picos que superan con creces la escala.
   6. Un día antes del experimento de microdiálisis, transfiera a los animales al sistema de EEG atado equipado con cilindros de plexiglás para microdiálisis. Desconecte a los animales del sistema de anclaje EEG en la jaula doméstica atornillando los conectores del electrodo sin sujetar al animal. Coloque al animal en los cilindros altos de plexiglás.

Figura 1. Preparación paso a paso del dispositivo a implantar. (A) Electrodo de 3 canales con electrodo de puesta a tierra de 10 cm de longitud en su funda protectora a la izquierda y cánula guía para microdiálisis a la derecha necesaria para el montaje del dispositivo. (B). El electrodo desnudo y la cánula guía en detalle. El primer paso es retirar (C) e insertar (D) la cánula guía metálica desde y dentro de su chupete de plástico varias veces para facilitar su liberación una vez implantada en la cabeza del animal. El segundo paso es doblar dos veces el electrodo de registro retorcido para alinearlo con la cánula guía de diálisis (E, F). (G) La punta del electrodo debe cortarse 0,5 mm más larga que la punta de la cánula guía metálica. (H) Compruebe la precisión del corte utilizando el calibrador digital. Posteriormente, se debe utilizar un anillo de silicona de aproximadamente 1 mm de largo para fijar la alineación del electrodo con el pie guía de la cánula (I). (J) La fotografía que muestra cómo hacer sonar el electrodo y guiar el eje de la cánula. El paso final es poner una gota de resina o pegamento sobre el pedestal de la cánula guía fijando el anillo de silicona a él (K). (L) Dispositivo ensamblado listo para ser esterilizado.

Figura 2. Fotografías de los diferentes tipos de dispositivos para microdiálisis-EEG en ratas utilizadas (A) y la fotografía del soporte del clip de la sonda (B) utilizado para implantar estos dispositivos. (A) La cánula guía (en verde) se sustituye por una cánula de microdiálisis, normalmente 24 horas antes del experimento. El conector eléctrico del dispositivo (el primero a la izquierda se utilizó para las grabaciones descritas en este manuscrito) permite la conexión de cables que conducen la señal eléctrica al amplificador y al equipo de recopilación de datos. El dispositivo se adhiere quirúrgicamente al cráneo de ratas anestesiadas y las grabaciones se pueden obtener posteriormente sin causar dolor o molestias en ratas que se comportan libremente.

Figura 3. Diseño experimental. La semana anterior a la inducción del estado epiléptico (EE), se implanta el dispositivo a las ratas. La EE es inducida por pilocarpina y los animales (si no se dializan y se matan a las 24 h después de la EE; las ratas del grupo agudo) se controlan por vídeo durante 5 días (línea azul) y luego se monitorizan por vídeo-EEG para evaluar la frecuencia y la duración de las convulsiones en sus jaulas domésticas (línea verde). Para el experimento de microdiálisis, las ratas epilépticas y las respectivas ratas de control no epilépticas se transfieren a otra configuración de EEG equipada con jaulas cilíndricas en 24 horas antes de la sesión de microdiálisis y se monitorea aún por video EEG (línea verde clara). Las líneas rojas verticales representan las sesiones de diálisis en diferentes momentos del desarrollo de la enfermedad epiléptica. Las líneas rojas horizontales representan los diferentes grupos de animales epilépticos (y sus respectivos animales no epilépticos), donde la flecha indica el último día de la microdiálisis y el día de la muerte del animal.