Registro de potenciales postsinápticos excitatorios del campo neuronal en cortes agudos del hipocampo

Resumen

Fuente: Weng, W., et al. Registro de la plasticidad sináptica en cortes agudos del hipocampo mantenidos en un sistema de cámara de tipo reciclaje, perfusión y inmersión de pequeño volumen. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra el procedimiento para configurar un corte de cerebro en una cámara de inmersión para registrar la actividad sináptica. El proceso consiste en asegurar el corte en papel de lente, mantener un flujo continuo de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) para garantizar la viabilidad neuronal y posicionar con precisión los electrodos de estimulación y registro en relación con una región específica del cerebro de interés. Esta configuración permite un seguimiento preciso de la actividad sináptica basal y de los efectos de la estimulación eléctrica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Registro de respuestas sinápticas en una cámara de corte por inmersión

>NOTA: Ver la tabla de materiales.

1. Precalentar la solución de líquido cefalorraquídeo en un baño de agua a unos 28-30 °C (esto evitará la formación de burbujas en la cámara de registro).
2. Ponga en marcha el sistema de reciclaje (4-5 mL/min) y active el calentador en línea para equilibrar el sistema durante al menos 1 h.
3. Remoje previamente un pequeño trozo de papel de limpieza de lentes y una malla de nailon fijada en un alambre de platino en forma de U en la cámara de corte de inmersión durante unos minutos (Figura 1).
4. Retira el alambre de platino en forma de U.
5. Apague el reciclaje y coloque una rebanada en el papel de limpieza de lentes.
6. Coloque inmediatamente la malla de sujeción de la rebanada encima de la rebanada, encienda la bomba y deje que la rebanada se equilibre durante 30 minutos sin sumergir el objetivo en el aCSF.
7. Llene la micropipeta de borosilicato (es decir, el electrodo de registro) con aCSF (resistencia de la punta: 1-2 MΩ, llene 1/3 con aCSF) y móntela en el soporte de pipetas.
8. Coloque el electrodo de estimulación de tungsteno con aislamiento epoxi probado en el soporte del manipulador y los cables de referencia en la cámara de corte.
9. Agregue un segundo electrodo de referencia a la cámara y conéctelo a la toma de referencia de la etapa principal del electrodo de registro (Figura 1A).
10. En el software de control del amplificador, haga clic en la casilla "modo de pinza cero" y proceda haciendo doble clic en la casilla "lista de ganancia de salida". Elija una ganancia de "100", haga doble clic en el "cuadro de lista de filtros de paso alto (Bessel)", elija "0,1 Hz" y haga doble clic en el "cuadro de lista de filtros de paso bajo (CA)" para elegir "3 kHz".
11. En el software de grabación, haga clic en "Adquirir | Elija un protocolo que tenga configuraciones que permitan estimulaciones episódicas y la digitalización de potenciales amplificados a 10-20 kHz durante 50-100 ms y que active automáticamente un aislador de estímulo 10 ms después del inicio de una grabación episódica.
12. Coloque los electrodos de estimulación y registro en línea y paralelos al estrato piramidal, por ejemplo (Figura 1B y Figura 2).
13. Haga clic en "Adquirir | Editar protocolo" y elija la pestaña "activador" (en la ventana emergente). Haga clic en el cuadro "fuente de activación" y elija "barra espaciadora" como fuente de activación. Haga clic en el botón "Aceptar". Haga clic en el botón "grabar" para iniciar la adquisición y observe la ventana emergente con un botón de activación.
14. En el software del aislador de estímulos, haga clic en la casilla "control de voltaje" e ingrese "0". Haga clic en el botón "descargar". Haga clic en la ventana "software de grabación" y presione la barra espaciadora. Repita este ciclo introduciendo secuencialmente los valores del 1 al 8, por ejemplo, en pasos de 1 mV en el cuadro "control de tensión".
15. Correlacione la fuerza de estimulación con los valores de fEPSP-slope y determine la fuerza de estimulación requerida para obtener el 40% del máximo de fEPSP-slope. Haga clic en el "cuadro de control de voltaje" e ingrese el valor determinado. Haga clic en el botón "descargar".
    nota: Un aislador de estímulo se utiliza para aplicar pulsos breves de voltaje o corriente al tejido cerebral. Los pulsos bifásicos pueden tener 100 μs por fase.
16. En el software de grabación, haga clic en el botón de parada y luego en el menú "Adquirir". Haga clic en "Editar protocolo" y elija la pestaña "activador" en la ventana emergente. Haga clic en el cuadro de la fuente de activación y elija el "temporizador interno" como fuente de activación. Haga clic en el botón "Aceptar". Haga clic en el botón de grabación que inicia el registro automático de potenciales de campo cada 30 s, por ejemplo. Haga clic en el botón "detener" después de 30-60 minutos.
17. Haga clic en el menú "Adquirir", haga clic en "Abrir protocolo", elija el protocolo de inducción deseado de plasticidad sináptica y haga clic en el botón "Aceptar". Haga clic en el botón "grabar" para activar automáticamente la estimulación y la grabación de alta frecuencia. Haga clic en el botón "detener".
    nota: En el caso de estudios relacionados con la plasticidad sináptica, aplique uno de los paradigmas de inducción estándar para la potenciación a largo plazo o la depresión a largo plazo después de un registro basal prolongado. En la Figura 4 y la Figura 5 se muestran ejemplos representativos de la modulación resultante de la transmisión sináptica.
18. En el software de grabación, haga clic en "Adquirir | Open Protocol" y elija el mismo protocolo que en el paso 4.12. Haga clic en el botón "Aceptar" y luego haga clic en "Grabar". Siga ejecutando automáticamente las grabaciones potenciales de campo durante 2-4 h, por ejemplo. Haga clic en el botón "detener" para finalizar la grabación.
19. En el caso de estudios farmacéuticos, aplique el compuesto directamente al depósito de aCSF si se desea la administración de compuesto permanente (Figura 3).

Resultados

Figura 1: Componentes de la carbogenación de salida para experimentos en una cámara de corte por inmersión. (A) Presentación de la cámara de corte por inmersión. Se representa el alambre de platino en forma de U con fibras de nailon que sostiene una rodaja en el hipocampo. Los alambres de plata se envolvían alrededor de una pequeña cánula, creando una bobina para aumentar el área del...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipos y materiales de electrofisiología
Extractor de pipetas vertical	Narishige, Japón	PC-10
Mesa de aislamiento de vibraciones	Meirits, Japón	ADZ-A0806
Cámara de registro de tipo sumergido	Instrumentos Warner	RC-26GLP
Baño de agua termostático	Zhongcheng Yiqi, China	HH-1
Micromanipulador de 4 ejes	Sutter, Estados Unidos	MP-285, MP-225
Alambre de platino	Instrumentos de precisión mundial	PTP406
amplificador	Dispositivos moleculares, EE. UU.	Multiclamp 700B
Sistema de adquisición de datos	Dispositivos moleculares, EE. UU.	Digidata 1440A
Software Anaysis	Dispositivos moleculares, EE. UU.	Clampex 10.2
Microscopio de fluorescencia	Nikon, Japón	FN1
Fuente de luz LED	Lumen Dynamics Group, Canadá	X-cite 120LED
Micropipetas	Aparato de Harvard	GC150TF	Grabación extracelular
Micropipetas de borosilicato	Sutter, Estados Unidos	BF150-86	abrazadera de parche
Electrodo de tungsteno	A-M Systems, EE. UU.	575500
Bomba peristáltica	Más tiempo, China	BT00-300T
Tubos para bomba peristáltica	ISMATEC, Wertheim, Alemania	SC0309	1x flujo de entrada, ID: 1,02 mm
Tubos para bomba peristáltica	ISMATEC, Wertheim, Alemania	SC0319	2x tubos para salida, ID: 2,79 mm
Cámara CCD	PCO, Alemania	pco.edge sCMOS
Papel de limpieza de lentes	Kodak
Tubo centrífugo cónico de 50 ml	Termo científico	339652
Precámara	Instrumentos Warner	BSC-PC
Calentador en línea	Instrumentos Warner	SF-28
Controlador de temperatura	Instrumentos Warner	TC-324B
Reactivos necesarios
NaCl	Reactivo químico Sinopharm, China	10019318
Kcl	Reactivo químico Sinopharm, China	10016318
KH2PO4	Reactivo químico Sinopharm, China	10017618
MgCl2·6H2O	Reactivo químico Sinopharm, China	10012818
CaCl2	Reactivo químico Sinopharm, China	10005861
NaHCO3	Reactivo químico Sinopharm, China	10018960
glucosa	Reactivo químico Sinopharm, China	10010518
NaH2PO4	Reactivo químico Sinopharm, China	20040718
HEPES	sigma	H3375
Piruvato de sodio	sigma	A4043
MgSO4	Reactivo químico Sinopharm, China	20025118
NaOH	Reactivo químico Sinopharm, China	10019718