Registros electrofisiológicos de preparaciones de tronco encefálico y médula espinal de un roedor recién nacido

Resumen

Fuente: Rousseau, J., et al. La electrofisiología en preparaciones aisladas de tronco encefálico y médula espinal de roedores recién nacidos permite el registro de la salida de la red respiratoria neuronal. J. Vis. Exp. (2015).

Este video muestra grabaciones electrofisiológicas de preparaciones aisladas de tronco encefálico y médula espinal de roedores recién nacidos. La preparación se coloca en una cámara de registro, y los estallidos inspiratorios del tronco encefálico se registran en condiciones de oxigenación y falta de oxígeno utilizando la raíz nerviosa del cuarto ventral en la médula espinal.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Configuración y preparación

1. Soluciones
   1. Prepare soluciones madre de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) de acuerdo con las siguientes recetas. Otras recetas con variaciones de concentración están disponibles en la literatura. Almacene las soluciones madre a 4 °C durante un máximo de un mes.
      1. Solución salina: añadir 75,39 g de NaCl (129 mM final); 2,5 g de KCl (3,35 mM final); 0,81 g de NaH₂PO4 (0,58 mM final); 2,33 g de MgCl₂ (1,15 mM final); 1,85 g de CaCl₂ (1,26 mM). Disolver en 800 ml de agua destilada y llenar hasta 1 L con agua destilada.
      2. Solución de bicarbonato: añadir 17,65 g de NaHCO₃ (21 mM final). Disolver en 900 ml de agua destilada y llenar hasta 1 L con agua destilada. Las variaciones de la concentración de bicarbonato darán lugar a variaciones del pH.
      3. Solución de glucosa: añadir 54,06 g de glucosa (30 mM final). Disolver en 400 ml de agua destilada y luego llenar hasta 500 ml con agua destilada.
   2. Prepare un líquido cefalorraquídeo diluyendo 100 ml de solución salina, 100 ml de solución de bicarbonato y 50 ml de solución de glucosa en 1 litro de agua destilada. Conservar a 4 °C hasta su uso.
   3. Prepare un electrodo de vidrio calentando y estirando un tubo de vidrio hasta que se rompa. Lija la punta antes de usarla. El electrodo se puede reutilizar muchas veces siempre que se mantenga limpio.
2. Configuración experimental
   nota: Los detalles de la configuración se presentan en la Figura 1.
   1. Encienda el amplificador, el promedio móvil, el sistema de adquisición de datos, el controlador de temperatura y la bomba. Compruebe la amplificación de la señal (ganancia = 10.000), la filtración (umbral bajo, 10 Hz; umbral alto, 5 kHz) y la frecuencia de muestreo de la conversión de analógico a digital de la señal bruta (2,5 kHz).
   2. Llene una botella con CSF y burbujeela con carbógeno (95% O₂, 5% CO₂). Inducir un flujo de aCSF burbujeado y calentado en la cámara de registro (volumen 5 ml) a 4 ml/min. Mantenga la temperatura en la cámara de registro a 26 (± 1) °C. El pH debe ser de 7,4 en estas condiciones estándar.
   3. Mantenga 50 ml de aCSF a temperatura ambiente (RT) y con burbujas de carbogen en una jeringa de 50 ml cerca de la cámara de disección.
   4. Encienda la computadora e inicie el software de grabación.

2. Disección

1. Pesar y determinar visualmente el sexo del animal (los machos tienen una distancia anogenital más larga, mientras que las hembras tienen una distancia anogenital corta; los genitales masculinos suelen ser oscuros, mientras que los genitales femeninos son rosados).
2. Anestesiar a los roedores recién nacidos mediante una de las siguientes opciones: crioanestesia (sumergir completamente al animal en hielo durante 4 – 5 min), inyección (equitensina a 4 ml/kg) o inhalación de anestésicos volátiles (isoflurano o éter). Confirmar un plano adecuado de anestesia por la ausencia de un reflejo de retirada de la pata.
3. Coloque al animal en el banco, ventral boca abajo. Seccionar la parte rostral de la cabeza coronalmente con un bisturí a nivel del bregma (visible a través de la piel y el cráneo). Realice este paso inmediatamente después de que el animal esté anestesiado.
4. Seccionar el cuerpo coronalmente con un bisturí debajo de los miembros anteriores.
5. Retire la piel, los músculos, los tejidos grasos y las vísceras con tijeras y alicates quirúrgicos y finos. Dado que los huesos son blandos a esta edad, tenga cuidado de no dañar el sistema nervioso. Realiza este paso en el banco.
6. Coloque la preparación en la cámara de disección. Utilice el aCSF almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación. Desde este punto hasta el final de la grabación, use un microscopio.
7. En la cara dorsal de la preparación, corte el cráneo y las vértebras desde la parte rostral hasta la caudal a lo largo del eje medio con tijeras y alicates quirúrgicos y finos. Abra el cráneo y las vértebras cortados para exponer el tejido nervioso. Utilice el aCSF almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación.
8. Con los alicates, retire la membrana aracnoidea, un tejido delgado que cubre la superficie del tejido nervioso. Retener la piamadre y los vasos sanguíneos contra el tejido nervioso. Utilice el aCSF almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación.
9. Coloque la preparación con la dorsal hacia abajo y baje con cuidado el tronco encefálico y la médula espinal cortando los nervios y el tejido conectivo con las tijeras mientras sostiene la preparación en su lugar. También es posible un abordaje dorsal. Mantenga las raíces y los nervios el mayor tiempo posible. Extraer los huesos para aislar el tronco encefálico y la médula espinal. Utilice el aCSF almacenado en la jeringa para oxigenar la preparación.
10. Retire el cerebelo y las estructuras rostral restantes seccionándolas con el bisturí. Utilice el aCSF almacenado en la aguja para oxigenar la preparación.
11. Opcionalmente, dependiendo del diseño experimental, se retira la protuberancia con el bisturí por una sección coronal anterior a la arteria cerebelosa inferior. Tenga en cuenta que mantener la protuberancia entera ralentizará el ritmo en las ratas y lo inhibirá por completo en los ratones. Las preparaciones que incluyen solo la parte caudal de la protuberancia muestran una actividad similar a la respiratoria con una frecuencia estable en la raíz C4.

3. Grabación

1. Coloque la preparación en la cámara de registro, con la ventral hacia arriba. Fije la preparación con clavos en la parte más baja de la médula espinal y en la parte más rostral del tronco encefálico.
2. Usando una jeringa unida al electrodo por su aguja, induzca una depresión en el electrodo (diámetro de la punta de vidrio: 150 - 225 μm) tirando del pistón de la jeringa, para llenar parcialmente el electrodo con aCSF.
3. Con un micromanipulador, coloque con cuidado el electrodo cerca de una de las raíces de la cuarta ventral. Otras raíces ventrales también podrían presentar una actividad similar a la respiratoria (p. ej., XII par craneal, C1 raíz ventral).
4. Induzca una depresión en el tanque de electrodos a través de la jeringa tirando del pistón hacia afuera para aspirar suavemente la raicilla nerviosa. A continuación, mueva con cuidado el electrodo para aplicarlo contra la médula espinal.
   nota: Idealmente, el tamaño de la raicilla coincide con el tamaño de la abertura del electrodo y, por lo tanto, crea un sello entre los compartimentos interno y externo del electrodo. Dado que los amplificadores diferenciales se utilizan comúnmente para este tipo de grabaciones, cualquier abertura entre el interior del electrodo y la cámara de grabación reduce la calidad de la señal y dificulta la eliminación del ruido de fondo.
5. Inicia la grabación.
6. Registre el ritmo producido por la preparación en condiciones normóxicas (es decir, aCSF burbujeado con carbógeno: 95% de_O2 y 5% de CO₂) durante al menos 20 minutos para determinar los parámetros de referencia de la preparación.
7. Cambiar la perfusión de aCSF con burbujas de carbógeno a aCSF de estímulo (es decir, burbujeado con 95% de_N2 y 5% de CO2 para el estímulo de hipoxia) durante 15 min. Modificar la duración de la exposición dependiendo del protocolo experimental. Registre la duración de la exposición en el registro y en la hoja de datos del animal. Utilice tubos de acero inoxidable entre la botella de aCSF y la cámara siempre que sea posible para evitar la difusión del gas hacia el exterior del tubo.
8. Vuelva a cambiar la perfusión a aCSF estándar con burbujas de carbógeno durante al menos 15 minutos para un registro de recuperación. Registre esto en la grabación y en la hoja de datos del animal.
9. Finaliza la grabación.

Resultados

Figura 1. Esquema recapitulativo del montaje.El aCSF burbujeado se calienta y se envía mediante una bomba en la cámara de registro. El exceso de líquido cefalorraquídeo en la cámara de registro se aspira mediante una bomba y se elimina. La cámara de registro está conectada a tierra y al controlador de temperatura. La salida del electrodo se transmite directamente al amplificador, luego al promedio mó...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sylgard	Sigma Aldrich	761036-5EA	Uso bajo el capó
NaCl	Biotienda	SOD002
Kcl	Biotienda	POC888
CaCl2	Biotienda	CCL444
MgCl2	Biotienda	MAG510
NaHCO3	Biotienda	SOB999
NaH2PO4	Biotienda	SPM306
D-glucosa	Biotienda	GLU501
Cárgeno	Linde	343-02-0006
Controlador de temperatura	Warner Instruments, Hamden, CT, EE. UU.	TC-324B
Electrodo de succión	A-M Systems, Everett, WA, EE. UU.	Modelo 573000
Amplificador diferencial de CA	A-M Systems, Everett, WA, EE. UU.	Modelo 1700
Promedio móvil	CWE, Ardmore, Pensilvania, Estados Unidos	modelo MA-821
Sistema de adquisición de datos	Dataq Instruments, Akron, OH, EE. UU.	modelo DI-720
Software LabChart	ADInstruments, Colorado Springs, CO, EE. UU.
Software de prisma	Graphpad, La Jolla, CA, EE. UU.
Cámara de grabación	Hecho en casa
base	Kanetec, Bensenville, Illinois, Estados Unidos
Micromanipulador	World Precision Instrument Inc, Sarasota, FL, EE. UU.	MB
base	Kanetec, Bensenville, Illinois, Estados Unidos	KITE-R
Bomba peristáltica	Gilson, Middleton, Wisconsin, Estados Unidos	MB
Jaula de Faraday	Hecho en casa	MINIPULS 3
ordenador