Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación quirúrgica
- Limpie y prepare el transmisor para garantizar una cirugía segura y estéril. Retire el transmisor de su embalaje antiestático y rocíe o sumerja en etanol al 70%. Enjuague el transmisor con solución salina estéril y colóquelo entre esponjas de algodón estériles empapadas en solución salina estéril o manténgalo sumergido en solución salina estéril.
- Recoja y esterilice las herramientas necesarias para la cirugía, autoclave de vapor para la esterilización. Consulte la tabla de materiales y reactivos para obtener la lista de herramientas quirúrgicas.
>2. Implantación quirúrgica
- Anestesiar a los animales y mantener la anestesia de acuerdo con el protocolo aprobado por la IACUC. Al inicio y durante la cirugía, controle el reflejo de pellizco del dedo del pie cada 15 minutos. La falta de respuesta indica un nivel suficiente de anestesia.
- Para los cachorros, utilizar anestesia por isoflurano (4%) conO2 (100%). Para adultos, use ketamina (100 mg/kg) con xilacina (10 mg/kg).
- Posición fija en el marco estereotáxico. Coloque las puntas de la barra de la oreja en el meato auditivo. No apriete excesivamente las barras de las orejas, ya que el cráneo es muy blando en las crías de ratas jóvenes. Asegure el cono de la nariz de la anestesia.
- Mantenga al animal caliente durante la cirugía colocándolo sobre la almohadilla térmica ajustada a 37 °C. En animales adultos, aplique ungüento lubricante en los ojos del animal.
- Esterilizar el sitio de la incisión y mantener el campo quirúrgico estéril.
- Frote el cuero cabelludo con aplicaciones alternas de etanol al 70% y betadine. Comienza en el centro del cuero cabelludo y haz círculos concéntricos cada vez más amplios.
- Cubra al animal con una cortina y realice la cirugía sobre el animal cubierto con una cortina. Mantenga el campo quirúrgico estéril forrando la configuración quirúrgica con paños estériles, rociando el equipo con etanol al 70%.
- Use guantes quirúrgicos estériles y una bata (o según lo requiera la institución). Para ayudar a mantener un campo estéril, use un asistente quirúrgico.
- Haga una incisión en el cuero cabelludo del animal ligeramente detrás de los ojos a lo largo de la línea media, aproximadamente 2 cm. Tenga cuidado al insertar el bisturí, ya que el cráneo aún es muy blando en las crías jóvenes de rata. Haga una sola incisión para que la incisión sangre menos y sane más rápido.
- Expone el cráneo. Prepare un área limpia y seca para maximizar la unión entre el transmisor y los huesos del cráneo. Use pinzas para aneurismas para agarrar el cuero cabelludo.
- Tire suavemente del cuero cabelludo lejos de la línea media en las cuatro esquinas. Busca puntos de referencia anatómicos como bregma y lambda en el cráneo. Recuerde que los huesos del cráneo no se fusionan en los animales a esta edad. Utilice el atlas de coordenadas estereotáxicas de Paxinos para encontrar la ubicación correcta del agujero de rebaba.
- Utilice una herramienta de tipo Dremel con una broca de tipo rebaba. Cree dos orificios de rebaba en las posiciones de grabación deseadas con orificios de más de 300 μm de diámetro. Coloque el orificio de rebaba para el electrodo de referencia sobre el cerebelo detrás de la lambda del cráneo.
- Asegúrese de que los cables del transmisor estén alineados con los orificios de rebaba. Si los cables de los electrodos no están alineados, es probable que los electrodos se contaminen con pegamento y darán como resultado una señal deficiente. Para alinear los cables, verifique el ajuste del transmisor y doble suavemente los electrodos para alinearlos sobre los sitios previstos para los agujeros de rebaba.
- Recorte los cables de los electrodos. Use tijeras quirúrgicas para recortar los electrodos a la longitud deseada. La profundidad del electrodo es importante para el tipo de registro requerido para el experimento (es decir, coloque los electrodos por encima de la duramadre para las grabaciones de EEG o use coordenadas estereotáxicas para estructuras cerebrales definidas).
- Aplique generosamente cianoacrilato en la base del transmisor para cubrir el área, asegurándose de evitar recubrir los electrodos. El pegamento de cianoacrilato es un aislante eléctrico, contaminar los electrodos con pegamento no dará como resultado ninguna señal.
- Si graba desde estructuras cerebrales profundas, monte el transmisor en el soporte de la cánula y colóquelo en el brazo estereotáxico para el control del eje z. Baje el transmisor con el brazo estereotáxico hasta la profundidad adecuada y coloque gel de cianoacrilato alrededor del transmisor.
- Seque completamente el cráneo antes de colocar el transmisor para asegurar una fuerte unión adhesiva. Aplique el transmisor recubierto con cianoacrilato en el cráneo. Tenga cuidado de alinear los electrodos con los orificios de rebaba correspondientes.
- Trate de evitar dañar las estructuras vasculares principales. Sostenga el transmisor en su lugar con una ligera presión durante un minuto. Use una ligera presión para formar una unión fuerte entre el transmisor y el cráneo.
- Aplique cianoacrilato adicional, suficiente para sellar completamente la interfaz transmisor/cráneo. Para garantizar un buen ajuste y una unión fuerte, maximice el área de superficie del pegamento que entra en contacto con el cráneo. Aplique el adhesivo de cianoacrilato en un círculo alrededor del transmisor, asegurándose de que tanto el cráneo como la pared del transmisor estén cubiertos.
- Aplique acelerante químico (0,1 ml) a través de una jeringa alrededor del cianoacrilato en la base del transmisor implantado. Use el acelerante con moderación, teniendo cuidado de no aplicarlo en el tejido adyacente.
nota: La aceleración química del curado con cianoacrilato asegura que el fuerte enlace entre el transmisor y el cráneo se forme rápidamente. El acelerante de cianoacrilato es útil para acelerar el curado del adhesivo, pero no es necesario.
- Retire el acelerante lavando bien el área con solución salina estéril. El acelerador de cianoacrilato puede causar irritación de los tejidos si no se lava desde el área de la incisión. Para lavar el área, llene una jeringa de 1.0 ml con solución salina estéril e irriga el área con una aguja de jeringa. Por lo general, 0,5 ml de solución salina son suficientes para lavar el acelerador.
- Sutura la piel alrededor de la base del transmisor, pero no lo cubras. La parte superior del transmisor debe estar por encima de la piel para transmitir señales neuronales de manera eficiente. La piel debe estar razonablemente apretada alrededor del transmisor y el pegamento alrededor de la unidad. Utilice Vicryl o sutura de seda (hilo suave); La piel de los animales inmaduros es blanda y se daña fácilmente si no se utilizan suturas blandas. En el caso de los animales adultos, utilice cualquier material de sutura.
- Retire al animal del marco estereotáxico y colóquelo sobre una manta térmica para su recuperación.
- Asegúrese de que los animales estén calientes (37 °C) y ambulatorios (es decir, completamente recuperados) antes de regresar a la presa. Asegúrese de que el animal esté hidratado pellizcando la piel del lomo del animal (si el animal está deshidratado, la piel permanecerá deformada). Si el animal está deshidratado, administrar una inyección subcutánea de tampón de Ringer lactato. No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
- Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) a los animales para el tratamiento del dolor postquirúrgico y una inyección subcutánea de 0,1 ml de bupivacaína alrededor del lugar de la inyección.
nota: De principio a fin, todo el procedimiento debe completarse en 5-10 minutos para los animales de esta edad (día postnatal 6). El tiempo quirúrgico puede llevar más tiempo para los animales mayores.
>3. Cuidado y Vivienda
Nota: Es posible que algunas madres no toleren cachorros implantados con el dispositivo. Es posible que sea necesario seleccionar madres que sean tolerantes. Es aceptable que la madre mueva a los cachorros alrededor de la jaula recogiéndolos por el transmisor.
- Una vez que los animales hayan sido destetados, colóquelos individualmente para evitar que se les quiten los dispositivos a su compañero de jaula.
- Sacrificar a los animales con dosis letales de pentobarbital (25 mg/kg) o isoflurano (en un frasco de campana) cuando haya signos de sufrimiento.
- Nota: algunas jaulas de alojamiento de animales con insertos de alambre pueden interferir con los transmisores implantados. Asegúrese de verificar la altura del inserto de alambre para asegurarse de que los animales no puedan atrapar el transmisor entre las "barras" del inserto de alambre.
4. Grabación de EEG
- Coloque al animal en una jaula sola o compartida con sus compañeros de camada y la madre. Sin embargo, coloque solo un animal implantado en una sola jaula. No deje a los cachorros solos en la cámara de grabación durante más de 2 horas. Vigile a los animales para detectar signos de angustia y deshidratación.
- Conecte la fuente de alimentación proporcionada a la base del receptor y verifique que la luz de alimentación esté iluminada. Conecte la base del receptor a un sistema de adquisición de datos mediante cables de bayoneta Neil-Concelman (BNC).
- Coloque la jaula del animal encima de la base del receptor (Figura 1). La luz de "señal" debe iluminarse para indicar que se ha detectado un transmisor. Ahora se pueden registrar los datos.
- Para registrar datos, conecte la base del receptor a un convertidor de analógico a digital y conecte el convertidor a una computadora (Figura 2).
- Ajuste la frecuencia de muestreo de la grabación. Asegúrese de que los datos se muestrean correctamente. Seleccione una frecuencia de muestreo de al menos 250 Hz (se recomiendan 500 Hz) para grabar (el ancho de banda del transmisor es de 0,1 a 100 Hz).
- Guarde los datos digitalizados y analícelos utilizando paquetes de software de procesamiento de señales como Matlab.
