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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Configuración para cortar trozos de cerebro
- Prepare una solución de corte compuesta por (mM) 125 colina-Cl, 2,5 KCl, 0,4 CaCl2, 6 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 D-glucosa saturada con gas carbógeno (95% O2-5% CO2) y una solución de registro de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) compuesta por (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 10 D-glucosa, saturado con carbógeno. Coloque la solución de corte sobre hielo para mantenerla fría.
- Congele aproximadamente 400 ml de la solución de corte y mezcle con 100 ml de solución de corte sin congelar para crear una suspensión de hielo. Burbuja con carbógeno (95 % Ø2-5 % CO2) a un caudal de aproximadamente 0,5 L/min a través de tubos de pequeño calibre o vidrio sinterizado para producir un flujo constante pero suave de burbujas.
- Prepare un vaso de precipitados de 250 ml con un inserto de malla de nailon en relieve sobre el que se colocarán las rodajas de cerebro. Rellene con CSF para cubrir la malla aproximadamente 2 cm y burbujee con cárgeno, asegurándose de que las burbujas no interrumpan directamente el área de retención de la rebanada. También es importante que no haya burbujas de aire en la malla de nylon, por lo que si las hay, retírelas. Esta será la cámara de retención y se mantiene a RT (20 - 25 °C).
- Coloque los instrumentos de disección, incluido un par grande de tijeras, un par pequeño de tijeras, microespátulas pequeñas y grandes, y pares grandes y pequeños de pinzas y enfríelos en hielo. Coloque el bloque de corte de tejido vibratome sobre hielo sobre un cuadrado de papel de aluminio. Consigue 2 hojas de papel de filtro de 6 cm, una cuchilla de afeitar de un solo filo y un vaso de precipitados de 25 ml lleno de la lechada de la solución de corte.
- Llene un segundo recipiente con hielo, coloque un trozo de papel de seda sobre el hielo y coloque un plato de cultivo de 12 cm encima. Llene la placa de cultivo con solución de corte, lechada de hielo y burbujee con carbógeno. Este es el recipiente en el que se realizará la disección del cerebro.
- Prepara el vibrátomo. Retire una hoja de afeitar nueva de doble filo (use una hoja nueva cada vez) de su envoltura y rocíe con etanol al 80% y luego agua desionizada. Corte una pipeta de transferencia de plástico de 3 ml en el punto donde comienza a estrecharse. Esto se utilizará para transferir cortes de cerebro. Doble una aguja de 27 G en la base aproximadamente 45° y conéctela a una jeringa de 1 ml. Esto se utilizará para manipular las rodajas durante el corte.
>2. Cortar rebanadas de cerebro
- Anestesiar un ratón (P16-P18) con isoflurano al 2% o un método aprobado localmente. Después de la inducción, decapitar al animal con un par de tijeras grandes y dejar caer la cabeza en la placa de cultivo de 12 cm que contiene la lechada de solución de corte burbujeante. La lechada debe sumergir totalmente la cabeza para un enfriamiento rápido.
- Sostenga la parte delantera de la cabeza con una mano, pelando la piel y el tejido conectivo hacia la nariz. Con las tijeras pequeñas, corte el tejido conectivo para revelar el cráneo subyacente. A continuación, retire los músculos que recubren la cara dorsal del cráneo y el cuello.
- Extraiga el cerebro del cráneo asegurando primero la parte delantera del cráneo con las pinzas grandes y luego haga dos cortes laterales a través del hueso a ambos lados del foramen magnum con las tijeras pequeñas (Figura 1, cortes etiquetados como A1 y A2).
- Haga otro corte entre los ojos (justo antes del bregma) (Figura 1, corte etiquetado como B) luego corte cuidadosamente a lo largo de la sutura sagital anteriormente y refleje las secciones del cráneo cortadas para revelar el cerebro (Figura 1, corte etiquetado como C).
- Use la espátula pequeña para sacar el cerebro y colóquelo en un plato de cultivo. Tenga en cuenta los nervios craneales en la cara inferior del cerebro que deberán cortarse, esto se puede hacer con la microespátula de menor tamaño. Con la espátula más grande, transfiera el cerebro al vaso de precipitados de 25 ml lleno de la lechada de la solución de corte.
- Preparando el hemisferio cerebral para el corte.
- Coloque una pieza de papel de filtro de 6 cm en el fondo de una placa de cultivo fresca, luego llénela con solución de corte fresca, lechada y burbujas. Use la espátula más grande para colocar el cerebro, con el lado ventral hacia abajo, sobre el papel de filtro. Toma una hoja de afeitar de un solo filo nueva y limpia y corta el cerebro para eliminar el cerebelo, luego haz un corte a lo largo de la línea media para separar el cerebro en dos hemisferios.
- Preparación del bloque de tejido vibratome.
- Tome el bloque de tejido de vibratomo frío, seque la superficie y coloque una gota de pegamento de cianoacrilato en el medio, y extiéndalo uniformemente hasta el tamaño aproximado del cerebro. Use la espátula pequeña para manipular uno de los hemisferios cerebrales en la microespátula grande para que el lado medial del cerebro quede hacia abajo.
- Toque el borde de la espátula en la interfaz del cerebro en la segunda hoja de papel de filtro para eliminar la mayor cantidad posible de la solución. Desliza el cerebro de la espátula más grande usando la espátula más pequeña para guiarlo hacia el pegamento.
- Asegure el bloque de corte en la cámara del vibratomo y llene la cámara con lechada y burbujas de solución de corte, asegurándose de que el cerebro esté completamente sumergido. Gire el bloque de corte para que el lado ventral del cerebro quede frente a la hoja.
- Cortar el cerebro.
nota: Cada vibratomo es único, así que siga las instrucciones del fabricante.
- Ajuste el grosor del corte a 450 μm y asegúrese de que la cuchilla vibre a medida que se mueve a través del cerebro a una velocidad de aproximadamente 0,3 mm/s. Cortado completamente a través del cerebro desde el lado ventral hasta la superficie cortical, esto producirá cortes sagitales de todo el cerebro que se pueden usar para registros electrofisiológicos. Las rebanadas se producirán de lateral a mediano y, por lo general, se pueden cortar de 3 a 4 rebanadas de cada hemisferio.
- Si la base de la rebanada se levanta, use la aguja doblada de 27 g para presionar suavemente la rebanada hacia abajo. A medida que se corta cada rebanada, utilice la pipeta de transferencia para moverla a la plataforma de la cámara de retención, donde son viables hasta 8 horas.
>3. Registros de electrofisiología extracelular
- Montaje del corte en la cámara de grabación.
- Con la pipeta de transferencia, coloque un trozo de cerebro en una cámara de grabación sumergida perfundida con líquido cefalorraquídeo que fluya a 1 - 2 ml/min y se caliente a 32 °C. El aCSF utilizado para las grabaciones difiere del de la cámara de retención, ya que la concentración de Mg2+ aumenta de 2 mM a 4 mM.
- Asegure la rebanada con un "arpa" (acero inoxidable semicircular con hebras de nailon estiradas a lo largo de 2 a 3 mm). Coloque el arpa de modo que las hebras corran paralelas a CA1. Aumentar la velocidad de perfusión a 8 - 10 ml/min a 32 °C.
- Bajo un microscopio de disección, coloque un electrodo estimulante y un electrodo de registro (electrodo de vidrio lleno de la solución de registro de aCSF) en la superficie del estrato radiado del CA1 (Figura 2A). Coloque primero el electrodo de estimulación, luego coloque el electrodo de registro.
- Estimule los colaterales de Schaffer con un pulso de prueba de amplitud de 120 a 150 μA y una duración de 0,1 mseg y observe la forma de onda del potencial postsináptico excitatorio de campo (fEPSP) resultante para determinar la salud del corte (Figura 2B). Es posible que sea necesario mover los electrodos de estimulación y registro al corte aproximadamente a 50 - 100 μm de la superficie del corte para obtener un registro de fEPSP con una pequeña descarga de fibra y una gran amplitud. Las fEPSP evocadas por la garantía de Schaffer son estereotipadas y proporcionan un buen indicador de la salud de las rebanadas. Las rebanadas sanas suelen mostrar una relación de amplitud entre la fibra y la fEPSP de menos de 0,3.
- Reposicionamiento de los electrodos.
- Usando un microscopio de disección, mueva el electrodo estimulante al centro del estrato oriens y mueva el electrodo de registro a la capa de la célula piramidal lo más cerca posible del electrodo de registro, como se muestra en la Figura 3A. Es posible que sea necesario empujar los electrodos de estimulación y registro en el corte aproximadamente 50 - 100 μm para que la amplitud de respuesta de fEPSP al pulso de prueba de 120 - 150 μA sea de aproximadamente 1 mV.
- Generando γ oscilaciones.
- Para generar γ oscilaciones, estimule el tejido con un tren de 20 pulsos de 0,1 mseg administrados a 200 Hz. Este estímulo tetánico puede producir respuestas reproducibles cuando se administra cada 5 minutos.
- Utilice los siguientes parámetros de grabación.
- Escale la ganancia de la señal de salida para que coincida con el rango de voltaje de entrada del convertidor de analógico a digital. Asegúrese de que la excursión de señal máxima esperada utilice un mínimo del 30% del rango de voltaje de entrada. Tenga cuidado al establecer ganancias demasiado altas, ya que las señales podrían recortarse. El ancho de banda típico necesario para las grabaciones de campo es de 500 Hz con acoplamiento de CA a 0,1 Hz para eliminar la deriva de la línea de base.
- Digitalice al menos 4 a 5 veces más rápido que la frecuencia de esquina del filtro de paso bajo para evitar el solapamiento de la señal.
