Registro de electrorretinograma de acoplamiento directo del epitelio pigmentario de la retina en un ratón

Resumen

Fuente: Miyagishima, K. J., et al. Electrorretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio pigmentario de la retina del ratón. J. Vis. Exp. (2020).

Este video muestra la grabación de un electrorretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) en un epitelio pigmentario de la retina (EPR) de ratón anestesiado y adaptado a la oscuridad. Después de aplicar gotas dilatadoras, el animal se coloca en una configuración de registro y el electrodo capilar lleno de un tampón de sal se coloca en la córnea. Después de establecer la línea de base, se registra el DC-ERG.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Posicionamiento del ratón y del electrodo

1. Mantenga a los ratones durante la noche en una caja bien ventilada y hermética a la luz para que se adapten a la oscuridad.
2. Los animales fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg/kg) y xilacina (8 mg/kg).
3. Aplicar una gota de HCl de proparacaína al 0,5% por vía tópica para anestesiar la córnea, así como una gota de HCl de fenilefrina al 2,5% y tropicamida al 0,5% para dilatar las pupilas.
4. Recorte los bigotes del ratón con unas tijeras para evitar que los espasmos involuntarios perturben los electrodos capilares de vidrio durante la grabación.
   nota: El protocolo de estímulo de electrorretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) dentro del sistema ERG tiene varias rutinas de estímulo incorporadas que se pueden seleccionar haciendo clic en el paso (flecha hacia adelante) o el paso (flecha hacia atrás). Solo se requieren los pasos 1, 4 y 5 del software para preparar y realizar la grabación DC-ERG.
5. En el sistema ERG, el software verifica que se ha seleccionado al paciente correcto. Haga clic en el botón verde Protocolos. En Descripción del protocolo, seleccione DC-ERG. A continuación, haga clic en Ejecutar. Verifique que esta sea la prueba correcta que se está realizando haciendo clic en Sí.
6. Utilice el estímulo de luz roja designado del paso 1/6 para encender la luz roja dentro del domo para ayudar a posicionar el mouse y los electrodos mientras observa los cambios en la impedancia.
7. Coloque el ratón sobre una mesa de grabación calefactada y cubra con cuidado la piel de la pata trasera con pinzas. Sostenga el electrodo de aguja firmemente en una mano e insértelo por vía subcutánea en la pata trasera para asegurarlo en su lugar.
8. Coloque el electrodo de referencia de plata/sidloruro (Ag/AgCl) (Tabla de materiales) dentro de la boca de modo que el pellet sinterizado descanse a lo largo de la mejilla posterior y se mantenga en su lugar detrás de los dientes><. nota: Los electrodos de alambre de oro no deben usarse como electrodo de referencia de boca, ya que tienen diferentes características de impedancia y aumentan el ruido de pico a pico.
9. Antes de colocar los electrodos capilares en el ojo del ratón, sujete el portaelectrodos con los capilares de vidrio verticalmente y golpee el portaelectrodos con el dedo índice para eliminar las burbujas que puedan haberse introducido. Llene la punta con la solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks utilizando una aguja de 25 g conectada a una jeringa e inspeccione para asegurarse de que no haya burbujas de aire atrapadas en la punta. Coloque el soporte del electrodo de modo que la punta abierta de los capilares llenos de HBSS esté en contacto suave con la córnea.
10. Use precauciones especiales para evitar la introducción de burbujas de aire sosteniendo el dispensador de gel lubricante para los ojos invertido y desechando las gotas iniciales. Coloque una gota de gel lubricante para los ojos en cada ojo para mantener la conductividad y evitar la desecación durante la grabación.

2. Grabación DC-ERG

1. Haga clic en Paso (flecha hacia adelante) para seleccionar Paso 4/6 "Long Flash No-Li".
2. Haga clic en Impedancia. Utilice la pantalla de comprobación de impedancia para examinar las resistencias de los ojos izquierdo y derecho. Se espera que los valores de impedancia para los electrodos de registro en cada ojo sean similares (~39 kΩ). Se espera que los valores de impedancia para la tierra y los electrodos de referencia sean inferiores a 10 kΩ).
3. Haga clic en Vista previa para ver los trazos del ojo izquierdo y derecho. Espere a que se alcance una línea de base estable (<10 min). Haga clic en Detener para salir de la vista previa de seguimiento.
   nota: Los cambios bruscos en la dirección de la deriva o el ruido aberrante en la grabación no mejorarán con el tiempo y requerirán identificar el electrodo capilar que necesita atención. La causa más probable es una burbuja introducida en la punta del electrodo. Rellene la punta con HBSS. Haga clic en Vista previa nuevamente para verificar la línea de base.
4. Haga clic en Paso (flecha hacia adelante) para seleccionar el Paso 5/6 "Long Flash 10 cd 7 min." Haga clic en Ejecutar para iniciar la grabación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Electrodo de Ag/AgCl (boca)	WPI Inc	EP1	Electrodo de referencia bucal para ratón
Baldosa de cerámica	Instrumento Sutter	Cts	Se utiliza para cortar el tubo capilar de vidrio a un tamaño adecuado
Bastón de limpieza con punta de algodón	Productos Médicos Puritanos	867-WC Sin pegamento	Se utiliza como espaciador para mejorar el ajuste del conjunto del portaelectrodos
Sistema de electrorretinograma (ERG)	Diagnosys LLC	Sistema E3	Sistema de electrofisiología visual para diagnosticar afecciones oftálmicas en la investigación de la visión y ensayos de fármacos
Quemador Bunsen	Tecnologías Argos	BW20002460	O equivlaent para dar forma al vidrio bajo llama
Tubo capilar de vidrio (1,5 mm)	Instrumentos Sutter	BF150-75	Para el llenado con HBSS y el contacto con la córnea
Solución salina tamponada de Hank (HBSS)	Thermo Fisher Scientific Inc	14175-095	Disponible comercialmente. Mantener en RT
Filtro en línea	Whatman	6722-5001	Para proteger la bomba de vacío de los aerosoles
Cable silencioso para soportes de microelectrodos	WPI Inc	5372	Sugerido para mejorar la longitud y la ubicación de los cables y los conjuntos de portaelectrodos
Rótula magnética	WPI Inc	500871	Para el posicionamiento magnético del conjunto del portaelectrodos en la platina
MatLab	Obras matemáticas		MatLab: Para editar el software de análisis
Caja de herramientas Curvefit de Matlab	Obras matemáticas		Toolbox for MatLab (solo necesario para editar el software de análisis)
Compilador de MatLab	Obras matemáticas		Toolbox for MatLab (solo necesario para editar y volver a publicar el software de análisis)
MatLab Runtime versión 9.5	Obras matemáticas	R2018b (9.5)	Necesario para ejecutar el software de análisis: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Soportes de microelectrodos (45 grados)	WPI Inc	MEH345-15	Para sujetar los capilares
Aguja (calibre 25)	Covidien	8881250313	Para el llenado de los tubos capilares con HBSS
electrodo de aguja (tierra)	Enlace rítmico	13mm - un elctrode	Electrodo de aguja subdérmica (tierra) para ratón (aguja de 13 mm de largo, 0,4 mm de diámetro, cable conductor de 1,5 m)
Regulador/Acondicionador de potencia	Furman	P-1800	O equivalente para eliminar la compensación de CC del ruido introducido a través de la línea eléctrica
Jeringa (12 mL)	Monoyecto	1181200777	Para el llenado de los tubos capilares con HBSS
Clip en T	Cole-Parmer	06852-20	Para el montaje de portaelectrodos
Desecador de vacío	Bel-Arte	420120000	Fondo y cubierta de policarbonato transparente
Tratamiento farmacológico
Gel lubricante para ojos	Alcon	0078-0429-47	Ayuda a lubricar la superficie de la córnea y a mantener el contacto eléctrico con los electrodos capilares
Clorhidrato de fenilefrina 2.5%	Akorn	17478-201-15	Gotas oftálmicas midriáticas de acción corta (para la dilatación de la pupila)
Clorhidrato de proparacaína 0,5%	Akorn	17478-263-12	Anestésico local para la instilación oftálmica
Tropicamida 0,5%	Akorn	17478-101-12	Gotas oftálmicas midriáticas de acción corta (para la dilatación de la pupila)
Xilacina	AnaSed	sc-362949Rx	Analgésico y relajante muscular
Zetamina (Ketamina HCl)	VetOne	501072	Anestésico para inyecciones intramusculares