Registros electrofisiológicos de Drosophila sensilla en respuesta a odorantes volátiles

Resumen

Fuente: Ng, R., et al. Registro electrofisiológico de Drosophila Trichoid sensilla en respuesta a odorantes de baja volatilidad. J. Vis. Exp. (2017).

En este video, una mosca Drosophila viva está montada en un tubo para estudios electrofisiológicos. Los electrodos se colocan en la base del sensillum para registrar respuestas neuronales específicas a las feromonas con las neuronas receptoras olfativas de la mosca.

Protocolo

1. Preparación del hardware para la grabación at4

1. Utilice un instrumento extractor de pipetas para preparar electrodos con capilares de vidrio de aluminosilicato (diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interno 0,64 mm). Emplanezca ligeramente la punta del electrodo de referencia con un par de pinzas finas para facilitar la inserción en el clípeo de la mosca (es decir, una placa redondeada en la parte delantera de la cabeza de la mosca, por encima de las piezas bucales)
   NOTA: En este estudio se utilizaron machos WT (tipo salvaje) de 7 días de edad (Berlín). Utilice una solución salina AHL como electrolito para ambos electrodos.
2. Prepare 1 L de AHL (Adult Hemolymph-Like) mezclando 900 mL de agua destilada con 6.312 g de NaCl, 0.373 g de KCl, 0.337 g de NaHCO₃, 0.1120 g de NaH₂PO₄, 1.892 g de Trehalosa ּ2H₂O, 3.423 g de sacarosa, 1.192 g de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico), y 8,2 mL de 1M MgCl₂. Usando agua destilada, lleve el volumen total hasta 1 L. Lleve el pH a 7.4 usando 1 N NaOH y esterilice la solución con un sistema de filtro accionado por vacío. Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga las alícuotas de AHL a 4 °C.
   NOTA: Las entregas constantes de ácido palmitoleico dependen de la uniformidad entre los cartuchos. Cada cartucho debe montarse de forma reproducible.
3. Con una cuchilla de afeitar, extraiga 0,9 cm de la punta de una punta de pipeta de 200 μL para crear la primera sección del cartucho, que mide 4,1 cm; consulte las dimensiones detalladas en la figura 1A. Utilice otra punta de pipeta de 200 μL y retire 1,7 cm y 1,5 cm de la punta y la base para crear la segunda sección del cartucho. midiendo 1,8 cm (Figura 1A). Utilice una regla para garantizar la reproducibilidad.
4. Use un perforador de 1/8" para cortar discos de papel de filtro.
5. Use pinzas para colocar un disco de papel de filtro en la punta de la segunda sección del cartucho. Confirme visualmente una abertura en la punta del cartucho a través de la cual puede pasar el aire.
6. Coloque la primera y la segunda sección del cartucho, como se muestra en la Figura 1A. Incline la segunda sección del cartucho hacia abajo para facilitar la orientación cuadrada a la preparación (Figura 1B).
7. Conecte el cartucho con el tubo de entrega de olores montado en un micromanipulador.
   NOTA: Este diseño permite que el cartucho se gire hacia afuera para facilitar el intercambio (Figura 1C).
8. Ajuste el flujo de aire humidificado constante a 2 L/min en un controlador de masa y el flujo de odorante a 500 mL/min en otro controlador de masa.
9. Usando el software (ver la Tabla de Materiales), programe el procedimiento para administrar una bocanada de olor de 500 ms.

2. Preparación de soluciones odorantes de ácido palmitoleico para su entrega

NOTA: Los ORNs Or47b responden tanto al ácido cis como al trans-palmitoleico. Dado que el ácido palmitoleico es inestable en RT, las existencias se almacenan a -20 °C y se utilizan en el plazo de un mes tras su apertura. El etanol es el disolvente de elección para el ácido palmitoleico.

1. Utilice un mezclador de vórtice para mezclar completamente 10 μL de caldos o diluciones de ácido cis- o trans-palmitoleico con 90 μL de etanol al 100% para diluciones en serie diez veces en microtubos de 1,7 mL. Prepare diluciones frescas de ácido palmitoleico diariamente antes de los experimentos y utilícelas dentro de un día.
   NOTA: Se recomienda un vial de vidrio para odorantes no solubles en etanol para preparar diluciones de olores con otros tipos de solventes orgánicos.
2. Con una micropipeta P10, aplique 5 μL de soluciones de ácido cis-palmitoleico de las diluciones deseadas al papel de filtro en cada cartucho correspondiente.
   NOTA: La dosis más alta (^10-1) contiene 450 μg del compuesto. Para soluciones de ácido transpalmitoleico, aplique 4,5 μL en su lugar para que la dosis más alta (^10-1 ) contenga 450 μg del compuesto.
3. Colocar los cartuchos de ácido palmitoleico en un desecador al vacío durante 1 h a RT y 7,59 mmHg de presión para evaporar completamente el disolvente.
   NOTA: Los cartuchos se pueden utilizar hasta 4 h en RT.

3. Preparación de Drosophila para el acceso inmediato al sensilla at4 para registros electrofisiológicos in vivo

NOTA: Las moscas WT (Berlín) se crían en medio estándar de harina de maíz a 25°C en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12. Tras la eclosiones, las moscas se separan por sexo en grupos de diez, por lo que se alojan en grupo hasta los 7 días de edad. Las ORNs (neuronas receptoras olfativas) Or47b en moscas macho y hembra responden al ácido palmitoleico. Para simplificar, solo se examinan moscas macho en el estudio actual.

1. Montar un portaobjetos de preparación para moscas: en un portaobjetos de vidrio, coloque un cubreobjetos de vidrio (18 x 18 mm2) sobre una pequeña cantidad de arcilla para modelar, formando un ángulo de ~3° con el portaobjetos de vidrio. Coloque cinta adhesiva de doble cara en el borde interior del cubreobjetos y en el área del portaobjetos inmediatamente debajo. Reemplácela con cinta nueva para cada día de grabación (Figura 2A).
2. Utilice un aspirador de moscas15 para recoger la mosca de interés en el tubo y, a continuación, coloque una punta de pipeta de 200 μl sobre el extremo del tubo. Al mismo tiempo, mueva el tubo hacia adelante mientras sopla aire en él para empujar la mosca hasta el extremo de la punta de la pipeta. Usa una hoja de afeitar para cortar justo debajo del cuerpo de la mosca y 2 cabezas por encima de la mosca.
3. Apisonar la parte inferior de la punta de la pipeta con arcilla para modelar, empujando la mosca hacia arriba hasta que tanto las antenas como el clípeo queden expuestos (Figura 2B). Para evitar matar a la mosca, agregue solo suficiente arcilla para exponer las antenas y las aristas, ya que esto evita que el abdomen de la mosca sea aplastado. Además, agregue arcilla lenta y suavemente para evitar cualquier constricción repentina. Confirme que la mosca está viva verificando el movimiento de la antena o la probóscide.
4. Utilice pinzas para maniobrar la punta de la pipeta que aloja la mosca. Orienta la cabeza de modo que el clípeo quede mirando hacia la derecha del observador. Ajuste la preparación a lo largo del cubreobjetos con pinzas finas hasta que el lado lateral de la antena quede contra la superficie del cubreobjetos con cinta adhesiva (Figura 2B).
5. Coloque una varilla de sujeción en el arista para asegurar la antena a la cinta de doble cara para evitar el movimiento (Figura 2B).
   NOTA: La varilla de sujeción se extrae de un capilar de vidrio de borosilicato con un extractor de pipetas y se mantiene en posición con arcilla para modelar (Figura 2A).
6. Coloque la preparación en la plataforma del equipo (Figura 2C). Usando el microscopio, confirme que el tricoide es visible a lo largo del borde distal-lateral del tercer segmento de la antena.
   NOTA: La silueta de la sensilla debe recortarse sobre el fondo, simplificando su identificación y facilitando el registro (Figura 3). En esta preparación, las sensilas tricoides más accesibles son del tipo at4.
7. Como se describió anteriormente, 2, 15, mantenga la preparación bajo un flujo de aire humidificado constante (2 L / min) suministrado a través de un tubo de suministro de aire separado a unos 2 cm de la preparación (Figura 4).

4. Registro de la actividad de at4 Sensillum de los ORNs or47b en los tricoides at4 en respuesta al ácido palmitoleico

1. Inserte el electrodo de referencia en el clípeo (Figura 3A). Con un movimiento rápido y suave, asegúrese de que el electrodo se inserte justo debajo de la superficie, donde pueda entrar en contacto con la hemolinfa debajo de la cutícula para evitar daños en los tejidos.
2. Baje el electrodo de registro lentamente hasta que entre en el mismo plano de visión que el sensillum objetivo (Figura 3B). Graba bajo un objetivo de 50X.
   nota: La cutícula trioidal resistente requiere insertar el electrodo de registro en la base del sensillar, cuya área más ancha proporciona un objetivo más grande que reduce la probabilidad de que el electrodo se desvíe (Figura 3B, recuadro).
3. Antes de aplicar estímulos olfativos a un sensillum, observe los siguientes criterios de selección: cualquier tricoide que no cumpla con estos estándares debe ser rechazado y en su lugar se debe elegir otro sensillum.
   1. Observe una alta relación señal-ruido (consulte la Figura 3C para ver un ejemplo).
   2. Observe picos identificables de las neuronas at4A y at4C (Figura 3C).
      NOTA: La amplitud del pico de at4B parece muy similar a la de at4A10 y no se puede identificar fácilmente sin la estimulación del olor.
   3. Observe que la tasa de disparo basal de las neuronas at4A es de alrededor o menos de 20 Hz.
      NOTA: Este criterio es específico para at4A porque la tasa de disparo basal de la neurona es mayor que la de los ORN basicónicos. Un disparo basal mucho más alto indica que las neuronas pueden haber sido dañadas durante la inserción del electrodo.
4. Conecte el cartucho al tubo de suministro de odorante. Comience con el control de solventes y luego los odorantes, de bajas a altas concentraciones. Utilice el micromanipulador para maniobrar el cartucho hacia la preparación mientras apunta el cartucho directamente a la cabeza de la preparación. Confirme visualmente que el cartucho está apuntando directamente a la antena (Figura 4) desde unos pocos milímetros de distancia.
   NOTA: El objetivo es orientar la abertura del cartucho directamente a la antena y colocarlo cerca del tejido objetivo.
5. Asegúrese de que el cartucho de odorante esté separado del electrodo de registro a su derecha por 1 a 2 mm y de la corredera de preparación de moscas por debajo aproximadamente 1 mm.
   nota: En la configuración descrita aquí, el cartucho de odorante está estrechamente bordeado por el electrodo de registro, el electrodo de referencia y el portaobjetos de preparación para moscas (Figura 4).
   NOTA: Tenga en cuenta la distancia entre el cartucho y los electrodos de registro/referencia. Se recomienda una distancia de unos 4 mm. El contacto involuntario puede terminar la señal y romper la punta del electrodo de registro, dañando la neurona actual y complicando las grabaciones posteriores><. NOTA: Tenga en cuenta la distancia que separa el cartucho de la corredera de preparación para moscas. Tocar el cubreobjetos también puede desplazar el electrodo de registro, interrumpiendo la grabación.
6. Presione "Grabar" en el software de adquisición de datos para comenzar la grabación.
   NOTA: Por cada grabación de 10 s, se suministra un único pulso de olor de 500 ms directamente a la antena, como se describe en el paso 1.9.
7. Después de aplicar el odorante, retraiga con cuidado el cartucho antes de reemplazarlo con un cartucho de la siguiente concentración más alta. Continúe hasta obtener todo el rango de dosis.
   NOTA: Solo se recomienda registrar un ORN Or47b de cada mosca para evitar cualquier posible efecto de la adaptación.
8. Enjuague bien el electrodo de registro con agua destilada después de terminar de grabar durante el día.
9. Analice y trace los datos utilizando software de análisis fuera de línea disponible en el mercado.

Resultados

Figura 1: Configuración del cartucho y el olfatómetro. (A) Preparación de cartuchos de olores. De izquierda a derecha: una punta de pipeta estándar de 200 μL, la primera y segunda secciones del cartucho y un cartucho de odorante completo. (B) El cartucho conectado al olfatómetro, que muestra el ángulo hacia abajo de la segunda sección. (C) Configuración del olfatómetro que representa el tubo de suministro de olor mon...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Configuración de preparación y materiales varios
Instrumento extractor de pipetas	Sutter Instruments ,Novato CA Estados Unidos	Pág. 97	Extractor de pipetas
Capilares de vidrio de borosilicato	Instrumentos de precisión mundial, Sarasota, FL, EE. UU	1B100F-4	para hacer varillas de sujeción
Capilares de vidrio de aluminosilicato	Sutter Instruments, Novato CA Estados Unidos	AF100-64-10	para hacer electrodos
Portaobjetos de microscopio Superfrost	Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU	12-550-143	para estación de preparación de moscas
Cinta adhesiva permanente de doble cara	Scotch St. Paul MN EE.UU.	Na	para estación de preparación de moscas
Microscopio vertical	Olimpo, Shinjuku, Tokio, Japón	BX51	para la plataforma de grabación
Plastalina para modelar	Van Aken, North Charleston, Carolina del Sur, Estados Unidos	B0019QZMQQ	para la estación de preparación y para estabilizar la varilla de sujeción
Unidad de filtro desechable estéril de flujo rápido con membrana SFCA, 0,45 mm	Nalgene, Rochester, NY, EE. UU	#156-4045	para esterilizar la solución de AHL
Punta de pipeta de 200 μL	VWR Radnor, Pensilvania, Estados Unidos	53508-810	para hacer cartuchos de olores y preparación para moscas
Papel de filtro	Whatman, Maidstone Kent Reino Unido	740-E	para hacer cartuchos de olores
Desecador de vacío	Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, Estados Unidos	VX-06514-30	para vaporizar solvente de etanol
ácido cis-palmitoleico	Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, Estados Unidos	#10009871 (CAS # 373-49-9)	Odorante Or47b
Ácido trans-palmitoleico	Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, Estados Unidos	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	Odorante Or47b
etanol	Spectrum Chemical MFG. New Brunswick, NJ, EE. UU.	E1028-500MLGL	para diluir el ácido palmitoleico
Micromanipulador de cartucho de odorante	Siskiyou, Grants Pass O EE. UU.	MX130R	para posicionar el olfatómetro
Software Flow Vision	Alicat, Tucson AZ Estados Unidos	FLOWVISIONSC	Software para controlar el caudal
Controlador de masa	Alicat, Tucson AZ Estados Unidos	MC-2SLPM-D	para controlar el caudal de aire humidificado
Controlador de masa	Alicat, Tucson AZ Estados Unidos	MC-500SCCM-D	para controlar el caudal para la estimulación de olores
Clampex	Dispositivos moleculares, Sunnyvale, CA, EE. UU.	Ver. 10.4	Software de adquisición de datos
Tubo de suministro de aire	Ace Glass, Vineland, Nueva Jersey, Estados Unidos	Números de 8802 a 936	para suministrar aire humidificado
Lente de objetivo de 50X	Olimpo, Shinjuku, Tokio, Japón	LMPLFL50X	Equipo de grabación
Ajuste de abrazadera 10	Dispositivos moleculares, Sunnyvale, CA, EE. UU.	Ver. 10.4	Software para el análisis de picos
Igor Pro 6	WaveMetrics, Lago Oswego O EE. UU.	Ver. 6.37	Software para el análisis de datos
Monitor de audio	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY, EE. UU	NPIEXB-AUDIS-08B	Informes auditivos de picos individuales
Amplificador extracelular	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY, EE. UU	NPIEXT-02F	para aumentar la amplitud de las señales eléctricas
Controlador de válvulas	Instrumentos Warner	VC-8	para controlar la apertura de la válvula para la estimulación de olores
Micromanipulador de electrodos de registro	Sutter Instruments, Novato CA Estados Unidos	MP-285	para colocar el electrodo de registro
Amplificador de escenario	ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY, EE. UU	EQ-16.0008	para aumentar la amplitud de las señales eléctricas
osciloscopio	Tektronix, Beaverton Oregón	TDS2000C	Informe visual de picos individuales

. . . . . principal .