Estimulación de la raíz nerviosa auditiva y registros de corriente postsináptica en un corte de cuña de cerebro de ratón

Resumen

Fuente: Fischl, M. J., et al. Preparación de cortes de cuña in vitro para imitar la conectividad de circuitos neuronales in vivo. J. Vis. Exp.(2020)

Este video muestra un protocolo para estimular la raíz del nervio auditivo y registrar las corrientes postsinápticas en las neuronas olivocochleares mediales en cortes de cuña de cerebro de ratón.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Configuración y registro de electrofisiología

1. Coloque la rebanada de cuña en la cámara de grabación y asegúrela con un arpa o un sistema estabilizador. Perfundir el tejido de forma continua a una velocidad de 7-10 mL/min con ACSF tibio (35 °C) burbujeado con carbógeno.
2. Identifique las neuronas MOC olivocochleares mediales marcadas genéticamente en el núcleo ventral del cuerpo trapezoidal VNTB utilizando epifluorescencia con filtros de emisión de 561 nm para registros de patch-clamp. Voltee la rebanada si no hay celdas potencialmente parcheables.
3. Usando la óptica DIC, concéntrese en la raíz del nervio auditivo en el lado grueso de la rebanada y use un micromanipulador para mover el electrodo estimulante de tungsteno bipolar hacia la raíz del nervio auditivo y suavemente hacia la superficie del tejido><. nota: Los electrodos de succión se han utilizado en experimentos de estimulación del nervio auditivo en otros laboratorios. Se pueden emplear electrodos de vidrio Theta o métodos de estimulación óptica si corresponden a otras preparaciones específicas.
4. Mueva el campo de visión de nuevo al VNTB para elegir una neurona MOC a la que dirigirse para la electrofisiología de la pinza de parche.
5. Llene una pipeta de grabación con una solución interna adecuada para el experimento propuesto.
6. Parche y registre desde la neurona MOC en la configuración de célula completa. Compense la capacitancia de la membrana y la resistencia en serie si es necesario.
7. Ajuste la amplitud de la estimulación eléctrica de la raíz del nervio auditivo para obtener eventos postsinápticos consistentes en la neurona MOC.
   nota: Puede ser necesario mover el electrodo de estimulación.
8. Ejecute protocolos de estimulación apropiados para observar las corrientes sinápticas evocadas en MOC (pinza de voltaje).
   nota: La preparación del corte en cuña se puede utilizar con cualquier herramienta típica de fijación de parches, como registros de parches sueltos, farmacología, optogenética, imágenes de calcio, liberación de neurotransmisores, etc.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio confocal vertical A1R	Instrumentos Nikon		Electrofisiología y microscopio de imagen, puede ser cualquier microscopio compatible con la electrofisiología
Electrodo de vidrio de borosilicato con filamento de 1,5 mm de diámetro exterior, diámetro interior de 1,1 mm, 10 cm de largo	Instrumento Sutter	BF150-110-10	Parche de sujeción de vidrio de pipeta
Relleno de electrodos MicroFil	WPI (en inglés	CMF20G	Relleno de pipeta de electrodo de parche
Calentador de solución en línea	Warner Instruments (GSAdvantage)	SH-27B	Calentador del sistema de perfusión Slice
Sistemas Multi-Micro-Manipuladores	Instrumentos Sutter	MPC-200 con MP285	Micromanipuladores para la fijación de parches y la colocación de electrodos de estimulación
P-1000 Extractor de pipetas horizontal para micropipetas de vidrio	Instrumentos Sutter	FG-P1000	Extractor de pipetas con abrazadera de parche
Amplificador de patch-clamp y software	HEKA	EPC-10 / Patchmaster Siguiente	Puede ser cualquier amplificador/software
Cámara de grabación	Instrumentos Warner	RC26G	Cortar el "baño" durante la grabación
Arpa de cámara de grabación	Instrumentos Warner	640253	Estabiliza el corte durante el registro electrofisiológico
Cámara de incubación Slice	Construcción personalizada		Cámara de retención calentada y oxigenada para las lonchas durante la recuperación después del corte
Unidad de aislamiento de estímulos	A.M.P.I.	Iso-Flex	Unidad de aislamiento de estímulos para electrofisiología
Jeringa 60CC	Fischer Scientific (Intramalls)	Teléfono 14-820-11	Electrofisiología, perfusión, manejo de fluidos
Controlador de temperatura	Warner Instruments (GSAdvantage)	TC-324C	Controlador de temperatura del sistema de perfusión de rebanadas
Tubo 1/8 OD 1/16 ID	Fischer Scientific (Intramalls)	14-171-129	Electrofisiología, perfusión, manejo de fluidos
Microelectrodo bipolar concéntrico Tugsten	WPI (en inglés	TM33CCINS	Electrodo estimulante para electrofisiología

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