Registro de las respuestas sinápticas de CA3-CA1 en un corte de hipocampo de rata

Resumen

Fuente: Shetty, M. S. et al., Investigación de Marcado/Captura Sináptica y Captura Cruzada utilizando Cortes Agudos de Hipocampo de Roedores.J. Vis. exp. (2015).

Este video muestra un método para registrar las respuestas sinápticas de CA3-CA1 en un corte de hipocampo de rata. Describe los pasos involucrados en la colocación de los electrodos estimulantes y de registro en el corte del hipocampo y la medición del potencial postsináptico excitador de campo (fEPSP) para evaluar la fuerza de la respuesta sináptica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Registro de las respuestas sinápticas CA3-CA1

NOTA: La configuración de electrofisiología utilizada para el registro de potencial de campo se muestra en la Figura 1A. Se recomienda encarecidamente una jaula de Faraday si la interferencia eléctrica está más allá del control después de la conexión a tierra adecuada de los ajustes eléctricos. Hay muchos tipos diferentes de cámaras sumergibles y de interfaz disponibles en el mercado. Sin embargo, se prefieren las cámaras de interfaz, ya que los segmentos exhiben respuestas sinápticas más robustas en ellas.

1. Posicionamiento de los electrodos
   1. Encienda los aparatos eléctricos (estimuladores y amplificadores) que se van a utilizar. Monte y asegure los electrodos de estimulación y registro en los soportes de plexiglás de los micromanipuladores.
      nota: Utilizamos electrodos monopolares, recubiertos de laca, de acero inoxidable de 5 MΩ de resistencia tanto para fines de estimulación como de registro.
   2. Antes de usar, inserte estos electrodos dentro de los capilares de vidrio extraídos y asegúrelos con pegamento epoxi, exponiendo solo una pequeña parte de la punta del electrodo (Figura 1E). Esto da fuerza a los electrodos, que de otro modo serían delgados, y ayuda a asegurarlos firmemente en los portaelectrodos.
   3. Guiado bajo el microscopio, coloque el (los) electrodo (s) estimulante (s) en el estrato radiado de la región CA1 para estimular las fibras colaterales de Schaffer y el electrodo de registro en la región dendrítica apical de CA1 para registrar las respuestas de campo EPSP (fEPSP).
      nota: Al acercarse a la superficie líquida por encima de la rebanada con los electrodos, se produce un sonido que ayuda a localizar rápidamente la superficie de la rebanada (siempre que el amplificador esté conectado a un altavoz).
   4. En los experimentos de marcaje y captura sináptica, de acuerdo con la necesidad del experimento, coloque dos o tres electrodos estimulantes (S1, S2 o S3) a cada lado del electrodo de registro para estimular dos o más entradas independientes pero superpuestas. Coloque los electrodos de estimulación y registro a una distancia de unos 200 μm.
   5. Si es necesario, ubique otro electrodo de registro en la capa del estrato piramidal para registrar el pico de población (Figura 2A). Cuando ambos electrodos hayan tocado el corte, utilizando el software de adquisición, proporcione una estimulación de prueba para garantizar una señal fEPSP adecuada.
      nota: Utilizamos pulsos bifásicos de corriente constante (duración del impulso de 0,1 mseg/media onda) para la estimulación de la prueba.
   6. Una vez que se haya obtenido una señal fEPSP adecuada, baje con cuidado los electrodos a unos 200 μm de profundidad utilizando las perillas de movimiento fino de los manipuladores. Espere 20 minutos para que las rodajas se recuperen.
2. Relación input-output
   1. Determine la relación entrada-salida (estimulación aferente frente a pendiente fEPSP) para cada entrada midiendo el valor de la pendiente en un rango de intensidades de corriente. Realice esto entre 20 μA y 100 μA. A continuación, ajuste la intensidad de estimulación para cada entrada para obtener el 40% de la pendiente máxima de fEPSP. Mantén esto constante durante todo el experimento.
   2. Después de 15-20 minutos, comience a registrar la línea de base. Monitoree de cerca la pendiente de fEPSP durante este período y restablezca la intensidad del estímulo si la pendiente fluctúa más del 10% del valor establecido y comience una nueva línea de base. Registre al menos 30 minutos o 1 hora de línea de base estable antes de continuar.
      nota: Para la prueba o la estimulación basal, utilizamos cuatro barridos de pulsos bifásicos de corriente constante de 0,2 Hz (0,1 mseg por polaridad) cada 5 min. Una pendiente promedio de estas cuatro respuestas se considera entonces como una repetición. Las señales se filtran y amplifican mediante un amplificador diferencial, se digitalizan mediante un convertidor de analógico a digital y se monitorizan en línea con un software hecho a medida.

Resultados

Figura 1.Configuración electrofisiológica para registros de potencial de campo que consta de: (A) estimuladores, (b) un amplificador diferencial, (c) un convertidor de analógico a digital, (d) osciloscopio, (e) computadora con software de adquisición, (f) microscopio de mesa resistente a las vibraciones, (g) con aumento de >4x, (h) interfaz, cámara de corte de cerebro, (i) un sist...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
I. Productos químicos componentes de ACSF
1. Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
2. Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
3. Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H20)	Sigma-Aldrich	M1880
4. Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O)	Sigma-Aldrich	C3881
5. Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
6. Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
7. D-glucosa anhidra (C6H12O6)	Sigma-Aldrich	G7021
II. Instrumentos de electrofisiología
1. Microscopio	Olimpo, Japón	Modelo SZ61
2. Controlador de temperatura	Diseño de Sistemas Científicos Inc. Canadá	PTC03
3. Amplificador de CA diferencial	AM Systems, EE. UU.	Modelo 1700
4. Estimulador de pulso aislado	AM Systems, EE. UU.	Modelo 2100
5. Osciloscopio	Rhode & Schwarz	HM0722
6. Convertidor digital-analógico	Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, Reino Unido	Potencia CED 1401-3
7. Cámara de corte de cerebro de interfaz	Diseño de Sistemas Científicos Inc. Canadá	BSC01
8. Bomba de tubería	Ismatec, Idex Salud y Ciencia, Alemania	REGLO-Analógico
9. Caudalímetro de carbógeno	Cole-Parmer	03220-44
10. Iluminador de luz de fibra	Industrias Dolan-Jenner	Fibra Lite MI-150
11. Micromanipuladores	Marzhauser Wetzlar, Alemania	00-42-101-0000 (MM-33)
		00-42-102-0000 (MM-32)
12. Electrodos	AM Systems, EE. UU.	571000 (Acero inoxidable; 0,010, 5MΩ, 8 grados)