>1. Preparación de la muestra
- Cruce la línea del conductor Gal4 a UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster vuela (w; P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Deje que la cruz crezca a 25 °C.
nota: La generación de moscas con múltiples copias de los transgenes Gal4 o UAS-GCaMP puede ayudar a mejorar la intensidad de la señal fluorescente. Una versión anterior del transgén UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) mostró una intensidad de fluorescencia muy débil cuando se expresó bajo el control del controlador Gr68a-Gal4.
- Recoger y separar por sexo las moscas adultas recién encerradas y criarlas a 25 °C.
NOTA: El nivel basal de fluorescencia GCaMP5G es óptimo en moscas de entre 14 y 28 días de edad. Aislar a las moscas por sexo excluye la posibilidad de interacciones sociales que puedan influir en las respuestas neuronales.
- Anestesia una mosca bajo un chorro leve de CO2.
- Fije la mosca a un cubreobjetos de vidrio colocando primero una pequeña gota de esmalte de uñas en el centro de un cubreobjetos de 0,17 mm. Coloque suavemente una mosca de costado sobre la gota de esmalte de uñas transparente y asegúrese de que la mosca cubra toda la gota.
- Realice los pasos 1.5 y 1.6 bajo un microscopio estereoscópico de disección, utilizado con un aumento de 8X.
- Usa un pincel húmedo para extender la pata delantera de la mosca. Asegure la pata delantera en su posición colocando dos tiras delgadas de cinta adhesiva sobre el primer y quinto segmento tarsiano (Figura 1A). Esto expondrá los segmentos tarsales T2-T4 para la obtención de imágenes (Figura 1B).
- Para obtener imágenes de las neuronas en la probóscide, coloque una tira delgada de cinta adhesiva sobre el rostro de la probóscide para exponer el labelo (Figura 1C, D).
- Dibuja una barrera hidrofóbica alrededor de la mosca con un bolígrafo PAP (peroxidasa-antiperoxidasa) para evitar que la solución fluya sobre la superficie del cubreobjetos. Mida dentro de los 30 minutos posteriores al montaje.
>2. Preparación de la solución de estímulo
- Ligandos lipofílicos diluidos (como CH503, utilizado en este estudio) en una solución PBST (solución salina tamponada con fosfato con Triton X-100): 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM deNa2HPO4, 1,8 mM de KH2PO4, 0,1% de Triton X-100 (v/v); pH 7,4.
- Prepare una solución madre de 1 mg/ml del ligando usando PBST. Prepare todas las diluciones posteriores de la solución madre utilizando PBST.
nota: Dependiendo de la solubilidad del ligando de interés, pueden ser necesarios diferentes disolventes para disolverlo. En la tabla 1 se describe la solubilidad del CH503 en diversos disolventes. A diferencia de otros disolventes, el PBST no aumentó la fluorescencia.
>3. Estimulación de las neuronas gustativas y adquisición de imágenes
- Con una pipeta de 10 μl, coloque 10 μl de PBST en los segmentos tarsales.
nota: Este paso humedece la pierna y evita que los segmentos del tarso se desplacen.
- Utilice un sistema óptico que tenga una cámara de suficiente velocidad y sensibilidad para lograr una buena señal de fluorescencia a alta resolución de tiempo.
nota: Para este estudio, se utilizó un microscopio confocal de disco giratorio y una cámara sCMOS (ver Lista de Materiales).
- Elija el segmento tarsiano específico y las neuronas que se van a fotografiar. Adquiere tres pilas Z confocales de preestimulación.
- Lo ideal es utilizar configuraciones de adquisición que sean lo suficientemente rápidas como para permitir la máxima resolución de tiempo mientras se captura todo el volumen de la celda. Ejemplos de configuraciones de adquisición son: exposición de 200 ms, agrupación de secciones ópticas de 2 x 2 y 6 x 0,5 μm2, capturadas cada 2 seg.
NOTA: Las piernas inmovilizadas se han visualizado con éxito durante un máximo de 10 minutos, a intervalos de 30 segundos, sin que se haya percibido un blanqueamiento de la señal GCaMP. Para tiempos de grabación más largos, asegúrese de que las patas estén muy firmemente sujetas en su lugar en el cubreobjetos.
- Optimice la potencia del láser para obtener la mayor relación señal-ruido posible con un fotoblanqueo mínimo durante todo el régimen de imágenes. Para los experimentos descritos aquí, utilice un láser de diodo de 491 nm (100 mW) con una transmisión del 30% para obtener imágenes de las neuronas gustativas Gr68a y ppk23 en las patas y la probóscide. Utilice la agrupación en bins de 2 x 2 para permitir tiempos de exposición más cortos y, al mismo tiempo, lograr una resolución espacial suficiente.
nota: Los ajustes de potencia del láser se optimizaron para detectar cambios fluorescentes que oscilan entre un aumento de 1,2 a 4,5 veces.
- Pipetear 10 μl de la solución de estímulo en los segmentos tarsales. Agregue otros 10 μl de PBST para experimentos de control. Adquiera inmediatamente 117 imágenes posteriores a la estimulación.
nota: El número de imágenes post-estimulación adquiridas se basa en el tiempo que se tardó en alcanzar el cambio máximo de fluorescencia (aproximadamente 2 min).
- PASO CRÍTICO: Al pipetear la solución en la preparación, no toque la mosca con la punta de la pipeta, ya que esto hará que la pata delantera se salga de su posición.
nota: Alternativamente, use un micromanipulador para colocar con precisión un capilar de vidrio que contenga estímulos cerca del segmento tarsiano que se va a obtener la imagen. Administre volúmenes controlados de estímulo utilizando un dispensador de microinyección intracelular de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
