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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Cirugía
NOTA: Los detalles exactos de la cirugía para la estimulación de circuito cerrado dependen del tipo de sondas de grabación utilizadas y de las áreas cerebrales a las que se dirijan. Sin embargo, en la mayoría de los casos, una cirugía típica constará de los siguientes pasos.
- Lleve una jaula con una rata a la sala de cirugía para que le implanten una sonda de silicona o una guía de electrodos para registrar la actividad neuronal.
- Anestesiar al roedor con isoflurano al 2-2,5% y fijar la cabeza en un marco estereotáxico. Asegúrese de que el animal esté inconsciente durante la cirugía observando cualquier reacción motora a estímulos táctiles leves.
- Aplique un ungüento para los ojos para minimizar la sequedad durante la cirugía.
- Afeitar la zona quirúrgica y desinfectar la piel con solución de clorhexidina al 2% y alcohol isopropílico al 70%.
- Inyecte lidocaína (5 mg/kg) debajo del cuero cabelludo sobre el área del cerebro donde se implantarán los electrodos.
- Haga una incisión en el cuero cabelludo sobre el área del futuro implante y use un bisturí y un hisopo de algodón para limpiar el periostio del cráneo expuesto.
- Taladre de 4 a 8 orificios en el cráneo para la implantación de tornillos de anclaje (~ 0,5 mm) como soporte estructural para el implante. Fije los tornillos al cráneo insertándolos en los orificios y asegúrese de que estén firmemente en su lugar.
- Perfore la craneotomía en las coordenadas especificadas e inserte el implante de microdrive/sonda.
nota: El protocolo descrito para la estimulación de circuito cerrado funcionará para cualquier región del cerebro en la que se inserten los electrodos.
- Fije el microdrive/sonda y cualquier conector de interfaz eléctrica requerido al cráneo con acrílico dental. La cantidad de acrílico dental debe ser suficiente para fijar el implante firmemente, pero no debe entrar en contacto con el tejido blando circundante.
- Después de la cirugía, vigile de cerca al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Durante los tres días siguientes, administrar por vía subcutánea un analgésico (p. ej., Metacam, 1 mg/kg) y un antibiótico para prevenir la infección (p. ej., enrofloxacino, 10 mg/kg).
nota: Por lo general, se deja que los animales se recuperen de la cirugía durante una semana antes de cualquier prueba o registro.
>2. Instalación de software
NOTA: Esto se probó en Windows 10, versión de 64 bits.
- Instale software de adquisición y procesamiento de datos.
- Instale el sistema de adquisición de datos Cheetah 6.4 (https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control), que incluye bibliotecas para interactuar con el sistema de adquisición Cheetah.
- Instale SpikeSort3D (https://neuralynx.com/software/spikesort-3d) o cualquier otro software que utilice KlustaKwik27 para la clasificación de picos. El software de detección en línea utiliza las definiciones de clúster del motor KlustaKwik. Este software puede ejecutarse en la misma computadora o en computadoras separadas en la misma red.
- Instale NetComDevelopmentPackage (https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0), que también se puede descargar desde https://neuralynx.com/software/netcom-development-package.
- Instale Matlab (https://www.mathworks.com/downloads/; el código se probó en la versión R2018a de Matlab). Asegúrese de que Matlab esté habilitado en el firewall de Windows. Normalmente, aparecerá una ventana emergente durante la primera conexión.
- Inicie sesión en una cuenta de Matlab. Elija la licencia. Elija la versión. Elija el sistema operativo.
- Descargue la siguiente biblioteca para la activación de eventos en línea desde https://github.com/leomol/cheetah-interface y extraiga archivos a la carpeta 'Documents/Matlab' de la computadora. Se proporciona una copia del código en los materiales complementarios adjuntos.
3. Adquisición inicial de datos
- Inicie la adquisición de datos con el software Cheetah.
- Registre unos minutos de datos de picos para rellenar las formas de onda de la plantilla.
- Detenga la adquisición de datos y realice una clasificación de picos en los datos registrados.
- Abra SpikeSort3D, haga clic en Archivo | Menú | Cargue el archivo Spike y seleccione un archivo Spike de la carpeta con los datos registrados.
- Haga clic en Menú de clúster, luego en Agrupación automática con KlustaKwik, dejando la configuración predeterminada, y haga clic en Ejecutar.
>4. Experimento de bucle cerrado
- Reanudar la adquisición de datos en Cheetah.
- Abre Matlab.
- Abra ClosedLoop.m y haga clic en Ejecutar. Alternativamente, en la ventana de comandos de Matlab, ejecute ClosedLoop(). Asegúrese de que ClosedLoop.m esté en la ruta de Matlab. Si el usuario desea emplear una función personalizada para llamar a cada desencadenador, ejecute ClosedLoop('-callback', customFunction) en su lugar, donde customFunction es un identificador de esa función.
- Cargue la información de picos definida en la grabación inicial haciendo clic en Cargar, navegando por la carpeta de grabación y seleccionando uno de los archivos de datos de picos (.ntt, .nse).
- Seleccione una o varias neuronas que desencadenarán la estimulación haciendo clic en la casilla de verificación debajo de las formas de onda trazadas.
- Defina el número mínimo de neuronas que desencadenarán la estimulación escribiendo un número entero en el cuadro de texto "coincidencias mínimas". A continuación, defina la ventana de tiempo en la que los picos que coinciden con diferentes formas de onda se consideran coactivos escribiendo un número en el cuadro de texto de la "ventana".
- Haga clic en Enviar para comenzar. Esto iniciará la activación en línea de eventos (tonos predeterminados) en función de la actividad de pico de las neuronas seleccionadas.