Estimulación optogenética y registro electrofisiológico de eventos sinápticos en cortes de cerebro de rata

Resumen

Fuente: Kinnavane, L., et al. Interrogación optogenética ex vivo de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad desde la corteza prefrontal medial hasta la corteza entorrinal lateral. J. Vis. Exp. (2022)

Este video demuestra el procedimiento para estudiar la eficiencia sináptica en la corteza entorrinal lateral (LEC) mediante la estimulación optogenética de los axones de la corteza prefrontal medial (mPFC) y el registro de las respuestas de las neuronas piramidales en la LEC. Este método combina registros de patch-clamp con activación sináptica por estimulación lumínica para estudiar la plasticidad sináptica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Electrofisiología y estimulación optogenética

1. Identificación de la célula diana.
   1. Coloque el corte en una cámara de registro sumergida a 34 °C perfundida con líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) a una velocidad de 2 mL/min mediante una bomba peristáltica. Inmovilice el sector con un anclaje de sector.
   2. Bajo el objetivo de bajo aumento (4x) de un microscopio de campo amplio que utiliza iluminación infrarroja oblicua, navegue hasta la capa 5 de la corteza entorrinal lateral (LEC). Mida la distancia desde la superficie del pial hasta la capa requerida.
      nota: La iluminación infrarroja oblicua se logró colocando un LED de infrarrojo cercano aproximadamente 3 mm por debajo del cubreobjetos de la cámara de registro en un ángulo de ~55° con respecto al plano del cubreobjetos (Figura 1B). El contraste de interferencia diferencial es una técnica de imagen alternativa y comúnmente utilizada para la electrofisiología de cortes.
   3. Cambie a un objetivo de inmersión en agua de gran aumento (40x) e identifique las neuronas piramidales. Marque la posición de la celda en el monitor de la computadora con cinta.
      nota: Las neuronas piramidales tienen una morfología aproximadamente triangular con dendritas apicales prominentes que se proyectan hacia la superficie pial de la rebanada (Figura 2A). La salud celular puede evaluarse mediante la ausencia de un núcleo condensado y visible y la inspección de la membrana plasmática, que debe parecer lisa. Es poco probable que el marcaje fluorescente claro de los axones por la proteína de fusión opsina-fluoróforo sea visible cuando se utiliza un microscopio de fluorescencia de campo amplio. Para visualizar las proyecciones axonales, se realiza inmunohistoquímica post-hoc utilizando un anticuerpo primario contra el fluoróforo de la opsina y se amplifica con un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo de la misma longitud de onda o similar.
2. Formación de pinza de parche de célula completa.​
   1. Fabricar una micropipeta de vidrio de borosilicato con un extractor de pipetas y llenarla con solución de registro intracelular filtrada (120 mM de k-gluconato, 40 mM de HEPES (N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico), 10 mM de KCl (cloruro de potasio), 2 mM de NaCl (cloruro de sodio), 2 mM de MgATP (trifosfato de adenosina de magnesio), 1 mM de MgCl (cloruro de magnesio), 0,3 mM de NaGTP (trifosfato de guanosina de sodio), 0,2 mM de EGTA (ácido etilenglicol tetraacético), y 0,25% de biocitina elaborada en UPW (agua ultrapura), pH 7,25, 285-300 mOsm). Coloque la micropipeta llena en el soporte de electrodos en la cabecera del amplificador de pinza de parche, asegurándose de que el cable del electrodo esté en contacto con la solución intracelular.
   2. Aplique presión positiva por la boca soplando con fuerza en una boquilla (como una jeringa de 1 ml sin el émbolo) conectada por un tubo al puerto lateral del portaelectrodos y mantenga la presión cerrando una válvula de tres vías en línea. Eleve el objetivo del microscopio de manera que se forme un menisco e inserte el electrodo en el menisco hasta que se pueda ver en el microscopio.
   3. Abra la ventana de prueba de sellado en WinLTP16 (u otro software de adquisición/osciloscopio) y, con el amplificador en el modo de pinza de voltaje, aplique un pulso cuadrado de 5 mV para determinar si la resistencia de la pipeta es de 3-6 MΩ.
   4. Acérquese y toque la célula identificada con la punta de la pipeta; esto debería dar lugar a una hendidura en la membrana celular (Figura 2A; panel derecho) y un pequeño aumento de la resistencia de la pipeta (0,1 MΩ).
   5. Libere la presión positiva y aplique la presión negativa aplicando una succión moderada en la boquilla; esto debería resultar en un gran aumento en la resistencia de la pipeta (>1000 MΩ). La presión ahora se puede dejar en punto muerto. Aplique presión negativa en una rampa que aumenta gradualmente hasta que la membrana celular se rompa, lo que resulta en transitorios de capacitancia de toda la celda.
3. Registre los eventos sinápticos evocados optogenéticamente.
   1. Introduzca la configuración de la pinza amperimétrica.
      NOTA: En la mayoría de los casos, la transmisión sináptica de largo alcance es glutamatérgica, por lo tanto, el registro a potenciales de membrana cercanos al potencial de inversión del cloruro aislará mejor la transmisión mediada por el receptor AMPA (AMPAR) y minimizará la medición de cualquier inhibición de retroalimentación (FFI) evocada. La inversión del cloruro depende de la composición de la solución de registro intracelular y del aCSF y puede calcularse utilizando la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz; para las soluciones anteriores, fue de -61,3 mV. Las neuronas piramidales LEC de capa 5 tenían un potencial de membrana en reposo promedio de -62 mV y, cuando fue necesario, se mantuvieron en este potencial mediante inyección de corriente constante. Alternativamente, las celdas se pueden sujetar con voltaje al potencial deseado. Para registrar proyecciones inhibitorias de largo alcance16 o para registrar FFI, pinza de voltaje a potencial de inversión catiónica para aislar la conductancia de cloruro GABAérgico. Cuando las neuronas de sujeción de voltaje se encuentran en potenciales de membrana por encima del umbral de potencial de acción, se utiliza una solución intracelular a base de cesio que contiene bloqueadores de los canales de sodio dependientes de voltaje para mejorar la pinza de voltaje y evitar el inicio de potenciales de acción (130 mM de CsMeSO4 (metanosulfonato de cesio), 10 mM de HEPES, 8 mM de NaCl, 5 mM de cloruro QX 314, 4 mM de MgATP, 0,5 mM de EGTA, 0,3 mM de NaGTP, 0,25% de biocitina fabricada en UPW, pH 7,25, 285-300 mOsm).
   2. Con el software de adquisición de datos, envíe señales lógicas de transistor-transistor (TTL) a un controlador LED (diodo emisor de luz) para activar un LED de 470 nm montado. El LED montado se dirige a la trayectoria de la luz del microscopio utilizando cubos de filtro y una óptica adecuada (Figura 1B) para aplicar pulsos de luz al corte a través del objetivo 40x para evocar potenciales postsinápticos excitatorios optogenéticos (oEPSP).
      nota: Los pulsos de luz se pueden aplicar perisomáticamente / sobre las dendritas, lo que resultará en la activación de opsinas en los axones y el botón presináptico, o el investigador puede mover el objetivo a los axones lejos de la célula registrada para evitar la estimulación del sobre-botón. La amplitud máxima de la oEPSP depende de la fuerza de la proyección sináptica, de la eficacia de las inyecciones virales y de la opsina utilizada. oLos EPSP pueden ajustarse a la amplitud deseada variando la intensidad y/o la duración de la luz18; La variación de la duración de los pulsos de luz (duración típica entre 0,2 y 5 ms a la potencia máxima de salida del LED, lo que da como resultado una densidad de luz de 4,4 mW/mm19) proporciona amplitudes oEPSP más consistentes que la alteración de la potencia de salida del LED.
   3. Investigar las propiedades de liberación presináptica (cambio en el voltaje) mediante la entrega de trenes de múltiples pulsos de luz con diferentes intervalos entre estímulos (Figura 2E); se debe tener cuidado al interpretar la transmisión evocada optogenéticamente.
   4. Investigar la plasticidad a largo plazo, ya sea mediante la invocación repetitiva de oEPSPs19 o la aplicación de ligandos. Monitoree la amplitud de oEPSP durante 5-10 min para garantizar la estabilidad antes de la inducción de la plasticidad, y luego monitoree hasta que se alcance una amplitud estable (generalmente 30-40 min).
      nota: La mayoría de las opsinas actuales no son capaces de evocar de forma fiable múltiples potenciales de acción a altas frecuencias, por ejemplo, 100 estímulos emitidos a 100 Hz, como se utiliza normalmente para inducir LTP.
   5. Para confirmar que las oEPSP son monosinápticas, se debe realizar una activación de la vía transducida colocando el objetivo sobre el árbol dendrítico y estimulando en presencia de 0,5 μM de tetrodotoxina y 100 μM de aminopiridina. La aplicación de tetrodotoxina suprimirá la transmisión si las respuestas son dependientes del potencial de acción, y la posterior inclusión de aminopiridina restablecerá parcialmente la transmisión si las oEPSPs se generan monosinápticamente19,20.
   6. Para permitir que la biocitina llene la neurona, espere al menos 15 minutos después de ingresar a la configuración de célula completa. En la abrazadera de voltaje, monitoree la capacitancia de la membrana y la resistencia de entrada.
   7. Retire lentamente la pipeta a lo largo del ángulo de aproximación alejándose del soma de la célula, observando la lenta desaparición de los transitorios de capacitancia y la corriente de membrana, lo que indica el nuevo sellado de la membrana celular y la formación de un parche de afuera hacia afuera en la punta de la pipeta. Tenga en cuenta la orientación del sector y la ubicación de las celdas dentro del sector. Coloque la rodaja en PFA (paraformaldehído) en una placa de 24 pocillos, incube durante la noche a 4 °C y luego transfiera a 0,1 M PB.
      nota: Las rebanadas se pueden almacenar hasta por una semana. Si se requiere un almacenamiento más prolongado, cambie el PB (tampón de fosfato) con regularidad o use PB que contenga azida de sodio (0,02%-0,2% de azida de sodio).

Resultados

Figura 1: Cámara de recolección de cortes y configuración óptica para registros visualizados de células completas, excitación optogenética e identificación de neuronas tdTomato-positivas. (A) La cámara de recolección de rebanadas14 está hecha a medida a partir de un estante de tubos de microcentrífuga pegado a una lámina de malla de nailon y colocado en un vaso de precipitados en el ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Válvula Luer de 3 vías	Cole-Parmer	WZ-30600-02
Objetivo 40x	Olimpo	LUMPLFLN40XW
4-aminopiridina	Hola Biografía	HB1073
4x objetivo	Olimpo	PLN4X/0.1
Lente acromática	Óptica Edmund	49363	Enfoca el espectro visual y el infrarrojo cercano
Microcentrífuga de sobremesa	Benchmark Científico	C1005*
Biocitina	Sigma-Aldrich	B4261
Capilar de vidrio de borosilicato	Instrumentos Warner	G150F-6
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Cámara - Qimaging Retiga Electro	Fotometría	01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	Año 2810
Exfoliante quirúrgico de clorhexidina	Vetasept	XHG008
tijeras podadoras	Andis	22445	Cortacuchillas desmontable AGC Super 2 velocidades
Lente de condensador de colimación	ThorLabs (en inglés)	ACL2520-A
Cubreobjetos	Fisher Scientific Ltd	10011913
Criostato	Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	C1426
Pegamento de cianoacrilato	Electrónica rápida Ltd	84-4557
Dispositivo de adquisición de datos	Instrumentos Nacionales	USB-6341 BNC
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G8270
Espejo dicroico de 500 nm de paso largo	Óptica Edmund	69899
Espejo dicroico de paso largo de 600 nm	Óptica Edmund	69901
Cubo de espejo dicroico	ThorLabs (en inglés)	CM1-DCH/M
EGTA	Millpore	324626
Portaelectrodos con puerto lateral	HEKA	895150
Filtro de emisiones	Chroma	59022m
Filtro de excitación	Chroma	ET570/20x
Gel para ojos	Dechra	Lubrithal
Pincel fino	Suministros de laboratorio científico	BRU2052
guillotina	Instrumentos de precisión mundial	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Solución de peróxido de hidrógeno	Sigma-Aldrich	H1009	30% (p/p)
Isoflurano	Henry Schein	Teléfono 988-3245
Isopentano	Sigma-Aldrich	M32631
Kcl	Sigma-Aldrich	P3911
K-gluconato	Sigma-Aldrich	G4500
Cubo de filtro de fluorescencia cinemática	ThorLabs (en inglés)	DFM1T1
Controlador LED	ThorLabs (en inglés)	LEDD1B
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Extractor de microelectrodos	Instrumentos Sutter	P-87
Jeringa de microinyección	Hamilton	7634-01/00
Aguja de jeringa de microinyección	Hamilton	7803-05	Especificación personalizada: calibre 33, longitud 15 mm, estilo de punta 4 - 12°
Bomba de jeringa de microinyección	Instrumentos de precisión mundial	UMP3T-1
LED azul montado	ThorLabs (en inglés)	M470L5
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
LED NIR	OSRAM	SFH4550	Utilizada para la obtención de imágenes IR refractadas de cortes, la óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC) es otro método comúnmente utilizado
Paraformaldehido	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldehido	Sigma-Aldrich	P6148
Amplificador de abrazadera de parche	Dispositivos moleculares	700A
Bomba peristáltica	Instrumentos de precisión mundial	Miniestrella
Portaobjetos de microscopio recubiertos de poli-L-lisina	Fisher Scientific Ltd	23-769-310
Cámara de grabación	Instrumentos Warner	RC-26G
Anclaje de corte	Instrumentos Warner	SHD-26-GH/15
Soporte estereotáxico para micro taladro	Aparato de Harvard	75-1874
sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389
Microscopio quirúrgico	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Filtro de jeringa para solución de registro intracelular	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
Microscopio de fluorescencia vertical	Leica	DM6 B
solución
aCSF
Solución de corte de sacarosa
PFA