Carga y descarga de colorantes FM mediada por microelectrodos en células nerviosas de larvas de Drosophila

Resumen

Fuente: Kopke, D. L., et al., FM Ciclo de colorante en la sinapsis: comparando la alta despolarización de potasio, la estimulación eléctrica y la canalrodopsina. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, las fibras nerviosas de las larvas de Drosophila se sumergen en un tinte FM, que se une a los lípidos de la membrana celular. El microelectrodo de succión y los pulsos eléctricos estimulan el proceso de endocitosis, incorporando el colorante FM en las vesículas endocíticas recién formadas. Este método, que visualiza las etapas presinápticas de la neurotransmisión, es útil para estudiar la función sináptica y la liberación de neurotransmisores.

Protocolo

1. Disección de pegamento larvario

1. Mezcle bien 10 partes de base de elastómero de silicona con 1 parte de agente de curado de elastómero de silicona del kit de elastómero.
2. Cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm con el elastómero y cure en una placa caliente a 75 °C durante varias horas (hasta que ya no estén pegajosas al tacto).
3. Coloque un solo cubreobjetos de vidrio recubierto de elastómero en la cámara de disección de plexiglás hecha a medida para la disección de larvas.
4. Prepare las pipetas de pegamento a partir de un capilar de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de microelectrodos estándar para obtener el cono y el tamaño de punta deseados.
5. Separe suavemente la punta de la micropipeta y, en el otro extremo, conecte 2 pies de tubo de plástico flexible (diámetro interior de 1/32", diámetro interior; diámetro exterior de 3/32", diámetro exterior; pared de 1/32"; con accesorio bucal (punta de pipeta P2).
6. En preparación para la disección de larvas, llene un recipiente pequeño (tapón de tubo Eppendorf de 0,6 ml) con un pequeño volumen (~20 μL) de pegamento.
7. Llene la cámara con solución salina (en mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 sacarosa y 5 2-[4-(2-hidroxietil)piperazina-1-il]etanosulfónico (HEPES) pH 7.2.
8. Añadir anticuerpo anti-rábano peroxidasa (HRP) conjugado con Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; diluir 1:10 a partir de un caldo de 1 mg/mL) para marcar el terminal presináptico NMJ durante la disección21,22.
9. Con un pincel fino (tamaño 2), retire un tercer estadio errante del vial de alimentos y colóquelo sobre el cubreobjetos recubierto de elastómero.
10. Llene la punta de la micropipeta de vidrio con un pequeño volumen de pegamento utilizando la presión de aire negativa generada por la boca con el accesorio (paso 1.5).
11. Coloque la larva con el lado dorsal hacia arriba con pinzas y pegue la cabeza al cubreobjetos recubierto de elastómero con una pequeña gota de pegamento usando presión de aire positiva por la boca.
12. Repita este procedimiento con el extremo posterior de la larva, asegurándose de que el animal esté estirado entre los dos accesorios de pegamento.
13. Con unas tijeras (hojas de 3 mm), haga un corte horizontal (~1 mm) en la parte posterior y un corte vertical a lo largo de la línea media dorsal.
14. Con pinzas finas # 4, retire suavemente la tráquea dorsal, el intestino, el cuerpo graso y otros órganos internos que cubren la musculatura.
15. Repita el procedimiento de pegado para las cuatro solapas de la pared del cuerpo; estire suavemente la pared del cuerpo horizontal y verticalmente.
16. Levante el cordón nervioso ventral (VNC) con fórceps, corte cuidadosamente los nervios motores con las tijeras y luego retire completamente el VNC.
17. Para detener el ciclo de SV, reemplace la solución salina de disección con solución salina libre de Ca²⁺ (la misma que la solución salina de disección anterior sin el CaCl₂).

2. Estimulación eléctrica FM Carga de tinte

1. Prepare una pipeta de succión con el extractor de microelectrodos para obtener el cono y el tamaño de punta requeridos.
2. Pula al fuego la punta del microelectrodo con una microforja hasta que un solo nervio motor pueda ser aspirado con un ajuste apretado.
3. Deslice la pipeta de succión en el soporte de electrodos de un micromanipulador y conéctela al tubo de plástico largo y flexible y a una jeringa.
4. Ajuste los parámetros del estimulador (por ejemplo, 15 V, frecuencia de 20 Hz, duración de 20 ms y tiempo de 5 min o 1 min.
5. Reemplace la solución salina libre de Ca²⁺ en la preparación larvaria con la solución salina FM1-43 anterior (4 μM; 1 mM CaCl₂) en el equipo de electrofisiología.
6. Coloque la preparación en la etapa del microscopio y eleve la etapa hasta que la larva y la pipeta de succión estén enfocadas (objetivo de inmersión en agua 40X).
7. Aspire un asa de nervio motor cortado que inerva el hemisegmento seleccionado con presión de aire negativa generada por la jeringa en el electrodo de succión.
8. Pruebe la función del electrodo de succión con una breve ráfaga de estimulación mientras monitorea visualmente la contracción muscular en el hemisegmento seleccionado.
9. Estimular el nervio motor utilizando los parámetros seleccionados (paso 2.4) para impulsar la endocitosis SV y la absorción del colorante FM1-43.
10. Lavar rápidamente con solución salina sin Ca²⁺ (5 veces durante 1 min) para eliminar completamente la solución de tinte FM1-43.
11. Mantenga la preparación larvaria en solución salina fresca libre de Ca²⁺ para obtener imágenes inmediatas utilizando el protocolo de imágenes confocales desde arriba.
12. Tome nota cuidadosamente de la imagen NMJ (segmento, lado y músculo) para garantizar el acceso a la misma NMJ después de la descarga del tinte FM.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de elastómero de silicona SylGard 184	Fisher Científico	NC9644388	Para poner en cubreobjetos para disecciones
Cubreobjetos para microscopio 22x22-1	Marca Pescadora	12-542-B	Para poner SylGard para las disecciones
Placa calefactora superior de aluminio tipo 2200	Termolino	HPA2235M	Para curar el SylGard
Cámara de disección de plexiglás	N/A	N/A	hecho a mano
Capilares de vidrio de borosilicato	WPI (en inglés	1B100F-4	Para hacer micropipetas de succión y pegamento
Extractor de micropipetas basado en láser	Instrumento Sutter	P-2000	Para hacer micropipetas de succión y pegamento
Tygon E-3603 Tubo de laboratorio	Suministro de componentes Co.	TET-031A	Para boca y pipeta de succión
Punta de pipeta P2	Científico de EE. UU	1111-3700	Para pipeta bucal
Tapón de tubo Eppendorf de 0,6 ml	Fisher Científico	05-408-120	Se utiliza para poner pegamento para la disección
Vetbond 3M	WPI (en inglés	Vetbond	Pegamento utilizado para disecciones
Cloruro de potasio	Fisher Científico	P-217	Forsalina
cloruro de sodio	Millipore Sigma	S5886	Para solución salina
Cloruro de magnesio	Fisher Científico	M35-500	Para solución salina
Cloruro de calcio dihidratado	Millipore Sigma	C7902	Para solución salina
sacarosa	Fisher Científico	T5-3	Para solución salina
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Para solución salina
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	Para etiquetar las membranas neuronales
pincel	Winsor y Newton	94376864793	Para manipular las larvas
Pinzas Dumont Dumostar #5	WPI (en inglés	500233	Se utiliza durante la disección
Microtijeras McPherson-Vannas de 7 cm (hojas de 3 mm)	WPI (en inglés	Año 14177	Se utiliza durante la disección
FM1-43	Fisher Científico	T35356	Tinte fluorescente de estirilo
Temporizador digital	VWR	62344-641	Para temporizar la carga/descarga del tinte FM
Micro-Forja	WPI (en inglés	MF200	Para pulir micropipetas de vidrio al fuego
Punta deslizante de jeringa de 20 ml	Bd	301625	Aspirar el axón para la estimulación eléctrica.
Micro Manipulador (base magnética)	Narishige	MMN-9	Para controlar el electrodo de succión para la estimulación eléctrica
estimulador	hierba	S48	Para controlar el LED y la estimulación eléctrica
Microscopio Zeiss Axioskop	Zeiss		Se utiliza durante la estimulación eléctrica.
40X Objetivo de inmersión en agua Achroplan	Zeiss		Se utiliza durante la estimulación eléctrica y la obtención de imágenes confocales
Microscopio Zeiss Stemi con puerto de cámara	Zeiss	2000-C	Se utiliza durante la estimulación de la canalrodopsina
Controlador LED T-Cube	ThorLabs (en inglés)	LEDD1B	Para controlar el LED
Fuente de alimentación LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Para alimentar el LED
Medidor óptico de potencia y energía	ThorLabs (en inglés)	PM100D	Para medir la intensidad de los LED