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Artículo de método

Carga y descarga de colorantes FM mediada por microelectrodos en células nerviosas de larvas de Drosophila

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8 de julio de 2025

En este artículo

Resumen

Fuente: Kopke, D. L., et al., FM Ciclo de colorante en la sinapsis: comparando la alta despolarización de potasio, la estimulación eléctrica y la canalrodopsina. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, las fibras nerviosas de las larvas de Drosophila se sumergen en un tinte FM, que se une a los lípidos de la membrana celular. El microelectrodo de succión y los pulsos eléctricos estimulan el proceso de endocitosis, incorporando el colorante FM en las vesículas endocíticas recién formadas. Este método, que visualiza las etapas presinápticas de la neurotransmisión, es útil para estudiar la función sináptica y la liberación de neurotransmisores.

Protocolo

1. Disección de pegamento larvario

  1. Mezcle bien 10 partes de base de elastómero de silicona con 1 parte de agente de curado de elastómero de silicona del kit de elastómero.
  2. Cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm con el elastómero y cure en una placa caliente a 75 °C durante varias horas (hasta que ya no estén pegajosas al tacto).
  3. Coloque un solo cubreobjetos de vidrio recubierto de elastómero en la cámara de disección de plexiglás hecha a medida para la disección de larvas.
  4. Prepare las pipetas de pegamento a partir de un capilar de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de microelectrodos estándar para obtener el cono y e....

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Divulgaciones

No se han declarado conflictos de interés.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de elastómero de silicona SylGard 184Fisher CientíficoNC9644388Para poner en cubreobjetos para disecciones
Cubreobjetos para microscopio 22x22-1Marca Pescadora12-542-BPara poner SylGard para las disecciones
Placa calefactora superior de aluminio tipo 2200TermolinoHPA2235MPara curar el SylGard
Cámara de disección de plexiglásN/AN/Ahecho a mano
Capilares de vidrio de borosilicatoWPI (en inglés1B100F-4Para hacer micropipetas de succión y pegamento
Extractor de micropipetas basado en láserInstrumento SutterP-2000Para hacer micropipetas de succión y pegamento
Tygon E-3603 Tubo de laboratorioSuministro de componentes Co.TET-031APara boca y pipeta de succión
Punta de pipeta P2Científico de EE. UU1111-3700Para pipeta bucal
Tapón de tubo Eppendorf de 0,6 mlFisher Científico05-408-120Se utiliza para poner pegamento para la disección
Vetbond 3MWPI (en inglésVetbondPegamento utilizado para disecciones
Cloruro de potasioFisher CientíficoP-217Forsalina
cloruro de sodioMillipore SigmaS5886Para solución salina
Cloruro de magnesioFisher CientíficoM35-500Para solución salina
Cloruro de calcio dihidratadoMillipore SigmaC7902Para solución salina
sacarosaFisher CientíficoT5-3Para solución salina
HEPESMillipore SigmaH3375Para solución salina
HRP:Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch123-605-021Para etiquetar las membranas neuronales
pincelWinsor y Newton94376864793Para manipular las larvas
Pinzas Dumont Dumostar #5WPI (en inglés500233Se utiliza durante la disección
Microtijeras McPherson-Vannas de 7 cm (hojas de 3 mm)WPI (en inglésAño 14177Se utiliza durante la disección
FM1-43Fisher CientíficoT35356Tinte fluorescente de estirilo
Temporizador digitalVWR62344-641Para temporizar la carga/descarga del tinte FM
Micro-ForjaWPI (en inglésMF200Para pulir micropipetas de vidrio al fuego
Punta deslizante de jeringa de 20 mlBd301625Aspirar el axón para la estimulación eléctrica.
Micro Manipulador (base magnética)NarishigeMMN-9Para controlar el electrodo de succión para la estimulación eléctrica
estimuladorhierbaS48Para controlar el LED y la estimulación eléctrica
Microscopio Zeiss AxioskopZeissSe utiliza durante la estimulación eléctrica.
40X Objetivo de inmersión en agua AchroplanZeissSe utiliza durante la estimulación eléctrica y la obtención de imágenes confocales
Microscopio Zeiss Stemi con puerto de cámaraZeiss2000-CSe utiliza durante la estimulación de la canalrodopsina
Controlador LED T-CubeThorLabs (en inglés)LEDD1BPara controlar el LED
Fuente de alimentación LEDCincon Electronics Co.TR15RA150Para alimentar el LED
Medidor óptico de potencia y energíaThorLabs (en inglés)PM100DPara medir la intensidad de los LED
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