Análisis del reciclaje de vesículas sinápticas y la absorción de colorantes fluorescentes en larvas de Drosophila

Resumen

Fuente: Kopke, D. L., et al., FM Ciclo de tinte en la sinapsis: comparación de la alta despolarización de potasio, la estimulación eléctrica y la canalrodopsina. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra un protocolo para estudiar el reciclaje de vesículas sinápticas en las uniones neuromusculares en larvas de Drosophila que expresan canalrodopsina utilizando un colorante fluorescente. La luz azul activa las canalrodopsinas, causando la entrada de calcio y la exocitosis de las vesículas sinápticas. El tinte se integra en las membranas neuronales y se internaliza durante la endocitosis, lo que da lugar a una mayor fluorescencia. Una mayor estimulación de la luz azul induce exocitosis y liberación de colorante, lo que se demuestra mediante la reducción de la fluorescencia.

Protocolo

1. Disección de pegamento larvario

1. Mezcle bien 10 partes de base de elastómero de silicona con 1 parte de agente de curado de elastómero de silicona del kit de elastómero (Tabla de materiales).
2. Cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm con el elastómero y cure en una placa caliente a 75 °C durante varias horas (hasta que ya no estén pegajosas al tacto).
3. Coloque un solo cubreobjetos de vidrio recubierto de elastómero en la cámara de disección de plexiglás hecha a medida (Figura 1, abajo) en preparación para la disección de larvas.
4. Prepare las pipetas de pegamento a partir de un capilar de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de microelectrodos estándar para obtener el cono y el tamaño de punta deseados.
5. Rompa suavemente la punta de la micropipeta y, en el otro extremo, conecte 2 pies de tubo de plástico flexible (diámetro interior de 1/32", diámetro interior; diámetro exterior de 3/32", diámetro exterior; pared de 1/32"; Tabla de Materiales) con herraje bucal (punta de pipeta P2).
6. Llene un recipiente pequeño (tapón de tubo Eppendorf de 0,6 ml) con un pequeño volumen (~20 μL) de pegamento (tabla de materiales) en preparación para la disección de larvas.
7. Llene la cámara con solución salina (en mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl₂, 1 CaCl₂, 70 sacarosa y 5 2-[4-(2-hidroxietil)piperazina-1-il]etanosulfónico (HEPES) pH 7.2.
8. Agregue el anticuerpo anti-rábano peroxidasa (HRP) conjugado con Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; diluir 1:10 de un caldo de 1 mg/mL) para marcar el terminal presináptico de la unión neuromuscular (NMJ) durante la disección.
9. Con un pincel fino (tamaño 2), retire una larva errante del tercer estadio del vial de alimento y colóquela sobre el vidrio de cobertura recubierto de elastómero.
10. Llene la punta de la micropipeta de vidrio con un pequeño volumen de pegamento utilizando una presión de aire negativa generada por la boca con el accesorio (paso 1.5).
11. Coloque la larva con el lado dorsal hacia arriba con pinzas y pegue la cabeza al cubreobjetos recubierto de elastómero con una pequeña gota de pegamento usando presión de aire positiva por la boca.
12. Repita este procedimiento con el extremo posterior de la larva, asegurándose de que el animal esté estirado entre los dos accesorios de pegamento.
13. Con tijeras (hojas de 3 mm; Tabla de Materiales), haga un corte horizontal (~1 mm) en la parte posterior y un corte vertical a lo largo de la línea media dorsal.
14. Usando pinzas finas (# 5, Tabla de Materiales), retire suavemente la tráquea dorsal, el intestino, el cuerpo graso y otros órganos internos que cubren la musculatura.
15. Repita el procedimiento de pegado para las cuatro solapas de la pared del cuerpo, asegurándose de estirar suavemente la pared del cuerpo tanto horizontal como verticalmente.
16. Levante el cordón nervioso ventral (VNC) con pinzas, corte cuidadosamente los nervios motores con unas tijeras y luego retire completamente el VNC.
17. Reemplace la solución salina de disección con solución salina libre de Ca²⁺ (igual que la solución salina de disección anterior sin el CaCl₂) para detener el ciclo de la vesícula sináptica (SV).

>2. Imagen: Microscopía confocal

1. Utilice un microscopio confocal vertical con un objetivo de inmersión en agua de 40X para obtener imágenes de la fluorescencia del colorante NMJ (se pueden utilizar otros microscopios).
2. Obtener imágenes del músculo 4 NMJ de los segmentos abdominales 2-4 (se pueden obtener imágenes de otros NMJ) y recopilar imágenes utilizando el software adecuado (Tabla de materiales).
3. Utilice un láser HeNe de 633 nm para excitar HRP:647 (con filtro de paso largo > 635 nm) y un láser de argón de 488 nm para excitar FM1-43 (con filtro de paso de banda de 530-600 nm).
4. Determine operativamente la ganancia y el desplazamiento óptimos para ambos canales.
   nota: Estos ajustes permanecerán constantes durante el resto del experimento.
5. Tome una pila Z confocal a través de todo el NMJ seleccionado desde la parte superior hasta la parte inferior del terminal sináptico marcado con HRP.
6. Tome nota cuidadosamente de la NMJ imageizada (segmento, lado y músculo) para asegurar el exceso exactamente del mismo NMJ después de la descarga del tinte FM.

>3. Estimulación de canalrodopsina FM Carga de colorante

1. Criar larvas que expresan ChR2 en alimentos que contengan el cofactor ChR2 all-trans retinal (disuelto en etanol; concentración final de 100 μM).
2. Coloque la preparación larvaria en la cámara de plexiglás en una platina de microscopio de disección equipada con un puerto de cámara.
3. Conecte un LED azul (470 nm; Tabla de Materiales) a un estimulador programable mediante un cable coaxial y coloque el LED en el puerto de la cámara.
4. Enfoque el haz de luz LED azul sobre la función larvaria disecada utilizando la función de zoom del microscopio.
5. Reemplace la solución salina libre de Ca²⁺ en la preparación larvaria con la solución salina FM1-43 anterior (4 μM; 1 mM CaCl₂) en la etapa optogenética.
6. Ajuste los parámetros del LED con el estimulador (por ejemplo, 15 V, frecuencia de 20 Hz, duración de 20 ms y tiempo de 5 min (Figura 2)).
7. Inicie la estimulación lumínica y realice un seguimiento con un temporizador durante la duración predeterminada del período de estimulación optogenética (por ejemplo, 5 min; Figura 2).
8. Cuando el temporizador se detenga, retire rápidamente la solución de tinte FM y reemplácela con solución salina sin Ca²⁺ para detener el ciclo SV.
9. Lavar en rápida sucesión con la solución salina sin Ca²⁺ (5 veces durante 1 min) para asegurarse de que la solución de tinte FM se elimine por completo.
10. Mantenga la preparación larvaria en solución salina fresca libre de Ca²⁺ para obtener imágenes inmediatas con el microscopio confocal utilizando el protocolo de imagen.
11. Tome nota cuidadosamente de la NMJ imageizada (segmento, lado y músculo) para garantizar el acceso exactamente a la misma NMJ después de la descarga del tinte FM.

>4. Estimulación de canalrodopsina: descarga de tinte FM

1. Reemplace la solución salina libre de Ca²⁺ por solución salina regular (sin colorante FM1-43) en la platina del microscopio de disección con el LED del puerto de la cámara enfocado en la larva.
2. Ajuste los parámetros del estimulador para la descarga (por ejemplo, 15 V, frecuencia de 20 Hz, duración de 20 ms y tiempo de 2 min (Figura 2).
3. Inicie la estimulación lumínica y realice un seguimiento con un temporizador durante la duración predeterminada del período de estimulación optogenética (por ejemplo, 2 min; Figura 2).
4. Cuando finalice el período del temporizador, retire rápidamente la solución de tinte FM y reemplácela con solución salina sin Ca²⁺ para detener el ciclo SV.
5. Lavar en rápida sucesión con solución salina sin Ca²⁺ (5 veces durante 1 min) para asegurarse de que el tinte externo se elimine por completo.
6. Mantenga la preparación larvaria en solución salina fresca libre de Ca²⁺ para obtener imágenes inmediatas con el microscopio confocal.
7. Asegúrese de obtener una imagen de la fluorescencia del tinte FM1-43 en el mismo NMJ mencionado anteriormente utilizando los mismos ajustes confocal.

Resultados

Figura 1: Diagrama de flujo del protocolo de carga de tinte FM1-43 en el NMJ de Drosophila. La disección con pegamento larvario produce una preparación de neuromusculatura aplanada, con el cordón nervioso ventral (VNC) proyectando nervios segmentarios desde la línea media ventral (Vm) hasta las matrices musculares de la pared corporal hemisegmentariamente repetidas (paso a). El VNC se corta sin corte...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de elastómero de silicona SylGard 184	Fisher Científico	NC9644388	Para poner en cubreobjetos para disecciones
Cubreobjetos para microscopio 22x22-1	Marca Pescadora	12-542-B	Para poner SylGard para las disecciones
Placa calefactora superior de aluminio tipo 2200	Termolino	HPA2235M	Para curar el SylGard
Cámara de disección de plexiglás	N/A	N/A	hecho a mano
Capilares de vidrio de borosilicato	WPI (en inglés	1B100F-4	Para hacer micropipetas de succión y pegamento
Extractor de micropipetas basado en láser	Instrumento Sutter	P-2000	Para hacer micropipetas de succión y pegamento
Tygon E-3603 Tubo de laboratorio	Suministro de componentes Co.	TET-031A	Para boca y pipeta de succión
Punta de pipeta P2	Científico de EE. UU	1111-3700	Para pipeta bucal
Tapón de tubo Eppendorf de 0,6 ml	Fisher Científico	05-408-120	Se utiliza para poner pegamento para la disección
Vetbond 3M	WPI (en inglés	Vetbond	Pegamento utilizado para disecciones
Cloruro de potasio	Fisher Científico	P-217	Forsalina
cloruro de sodio	Millipore Sigma	S5886	Para solución salina
Cloruro de magnesio	Fisher Científico	M35-500	Para solución salina
Cloruro de calcio dihidratado	Millipore Sigma	C7902	Para solución salina
sacarosa	Fisher Científico	T5-3	Para solución salina
HRP:Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	Para etiquetar las membranas neuronales
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Para solución salina
pincel	Winsor y Newton	94376864793	Para manipular las larvas
Pinzas Dumont Dumostar #5	WPI (en inglés	500233	Se utiliza durante la disección
Microtijeras McPherson-Vannas de 7 cm (hojas de 3 mm)	WPI (en inglés	Año 14177	Se utiliza durante la disección
FM1-43	Fisher Científico	T35356	Tinte fluorescente de estirilo
Temporizador digital	VWR	62344-641	Para temporizar la carga/descarga del tinte FM
Microscopio confocal de barrido láser LSM 510 META	Zeiss		Para la obtención de imágenes de los marcadores fluorescentes
Zen 2009 SP2 versión 6.0	Zeiss		Software para la adquisición de imágenes en confocal
Láser HeNe de 633 nm	Lasos	Para excitar HRP:647 durante la obtención de imágenes
Láser de argón de 488 nm	Lasos		Para excitar el tinte FM durante la obtención de imágenes
Micro-Forja	WPI (en inglés	MF200	Para pulir micropipetas de vidrio al fuego
estimulador	hierba	S48	Para controlar el LED y la estimulación eléctrica
Retinal totalmente trans	Millipore Sigma	R2500	Cofactor esencial para ChR2
Microscopio Zeiss Stemi con puerto de cámara	Zeiss	2000-C	Se utiliza durante la estimulación de la canalrodopsina
LED 470nm	ThorLabs (en inglés)	M470L2	Se utiliza para la activación de ChR
Controlador LED T-Cube	ThorLabs (en inglés)	LEDD1B	Para controlar el LED
Fuente de alimentación LED	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Para alimentar el LED
Medidor óptico de potencia y energía	ThorLabs (en inglés)	PM100D	Para medir la intensidad de los LED
40X Objetivo de inmersión en agua Achroplan	Zeiss	Se utiliza durante la estimulación eléctrica y la obtención de imágenes confocales