1. Disección de pegamento larvario
- Mezcle bien 10 partes de base de elastómero de silicona con 1 parte de agente de curado de elastómero de silicona del kit de elastómero (Tabla de materiales).
- Cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm con el elastómero y cure en una placa caliente a 75 °C durante varias horas (hasta que ya no estén pegajosas al tacto).
- Coloque un solo cubreobjetos de vidrio recubierto de elastómero en la cámara de disección de plexiglás hecha a medida (Figura 1, abajo) en preparación para la disección de larvas.
- Prepare las pipetas de pegamento a partir de un capilar de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de microelectrodos estándar para obtener el cono y el tamaño de punta deseados.
- Rompa suavemente la punta de la micropipeta y, en el otro extremo, conecte 2 pies de tubo de plástico flexible (diámetro interior de 1/32", diámetro interior; diámetro exterior de 3/32", diámetro exterior; pared de 1/32"; Tabla de Materiales) con herraje bucal (punta de pipeta P2).
- Llene un recipiente pequeño (tapón de tubo Eppendorf de 0,6 ml) con un pequeño volumen (~20 μL) de pegamento (tabla de materiales) en preparación para la disección de larvas.
- Llene la cámara con solución salina (en mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 sacarosa y 5 2-[4-(2-hidroxietil)piperazina-1-il]etanosulfónico (HEPES) pH 7.2.
- Agregue el anticuerpo anti-rábano peroxidasa (HRP) conjugado con Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; diluir 1:10 de un caldo de 1 mg/mL) para marcar el terminal presináptico de la unión neuromuscular (NMJ) durante la disección.
- Con un pincel fino (tamaño 2), retire una larva errante del tercer estadio del vial de alimento y colóquela sobre el vidrio de cobertura recubierto de elastómero.
- Llene la punta de la micropipeta de vidrio con un pequeño volumen de pegamento utilizando una presión de aire negativa generada por la boca con el accesorio (paso 1.5).
- Coloque la larva con el lado dorsal hacia arriba con pinzas y pegue la cabeza al cubreobjetos recubierto de elastómero con una pequeña gota de pegamento usando presión de aire positiva por la boca.
- Repita este procedimiento con el extremo posterior de la larva, asegurándose de que el animal esté estirado entre los dos accesorios de pegamento.
- Con tijeras (hojas de 3 mm; Tabla de Materiales), haga un corte horizontal (~1 mm) en la parte posterior y un corte vertical a lo largo de la línea media dorsal.
- Usando pinzas finas (# 5, Tabla de Materiales), retire suavemente la tráquea dorsal, el intestino, el cuerpo graso y otros órganos internos que cubren la musculatura.
- Repita el procedimiento de pegado para las cuatro solapas de la pared del cuerpo, asegurándose de estirar suavemente la pared del cuerpo tanto horizontal como verticalmente.
- Levante el cordón nervioso ventral (VNC) con pinzas, corte cuidadosamente los nervios motores con unas tijeras y luego retire completamente el VNC.
- Reemplace la solución salina de disección con solución salina libre de Ca2+ (igual que la solución salina de disección anterior sin el CaCl2) para detener el ciclo de la vesícula sináptica (SV).
>2. Imagen: Microscopía confocal
- Utilice un microscopio confocal vertical con un objetivo de inmersión en agua de 40X para obtener imágenes de la fluorescencia del colorante NMJ (se pueden utilizar otros microscopios).
- Obtener imágenes del músculo 4 NMJ de los segmentos abdominales 2-4 (se pueden obtener imágenes de otros NMJ) y recopilar imágenes utilizando el software adecuado (Tabla de materiales).
- Utilice un láser HeNe de 633 nm para excitar HRP:647 (con filtro de paso largo > 635 nm) y un láser de argón de 488 nm para excitar FM1-43 (con filtro de paso de banda de 530-600 nm).
- Determine operativamente la ganancia y el desplazamiento óptimos para ambos canales.
nota: Estos ajustes permanecerán constantes durante el resto del experimento.
- Tome una pila Z confocal a través de todo el NMJ seleccionado desde la parte superior hasta la parte inferior del terminal sináptico marcado con HRP.
- Tome nota cuidadosamente de la NMJ imageizada (segmento, lado y músculo) para asegurar el exceso exactamente del mismo NMJ después de la descarga del tinte FM.
>3. Estimulación de canalrodopsina FM Carga de colorante
- Criar larvas que expresan ChR2 en alimentos que contengan el cofactor ChR2 all-trans retinal (disuelto en etanol; concentración final de 100 μM).
- Coloque la preparación larvaria en la cámara de plexiglás en una platina de microscopio de disección equipada con un puerto de cámara.
- Conecte un LED azul (470 nm; Tabla de Materiales) a un estimulador programable mediante un cable coaxial y coloque el LED en el puerto de la cámara.
- Enfoque el haz de luz LED azul sobre la función larvaria disecada utilizando la función de zoom del microscopio.
- Reemplace la solución salina libre de Ca2+ en la preparación larvaria con la solución salina FM1-43 anterior (4 μM; 1 mM CaCl2) en la etapa optogenética.
- Ajuste los parámetros del LED con el estimulador (por ejemplo, 15 V, frecuencia de 20 Hz, duración de 20 ms y tiempo de 5 min (Figura 2)).
- Inicie la estimulación lumínica y realice un seguimiento con un temporizador durante la duración predeterminada del período de estimulación optogenética (por ejemplo, 5 min; Figura 2).
- Cuando el temporizador se detenga, retire rápidamente la solución de tinte FM y reemplácela con solución salina sin Ca2+ para detener el ciclo SV.
- Lavar en rápida sucesión con la solución salina sin Ca2+ (5 veces durante 1 min) para asegurarse de que la solución de tinte FM se elimine por completo.
- Mantenga la preparación larvaria en solución salina fresca libre de Ca2+ para obtener imágenes inmediatas con el microscopio confocal utilizando el protocolo de imagen.
- Tome nota cuidadosamente de la NMJ imageizada (segmento, lado y músculo) para garantizar el acceso exactamente a la misma NMJ después de la descarga del tinte FM.
>4. Estimulación de canalrodopsina: descarga de tinte FM
- Reemplace la solución salina libre de Ca2+ por solución salina regular (sin colorante FM1-43) en la platina del microscopio de disección con el LED del puerto de la cámara enfocado en la larva.
- Ajuste los parámetros del estimulador para la descarga (por ejemplo, 15 V, frecuencia de 20 Hz, duración de 20 ms y tiempo de 2 min (Figura 2).
- Inicie la estimulación lumínica y realice un seguimiento con un temporizador durante la duración predeterminada del período de estimulación optogenética (por ejemplo, 2 min; Figura 2).
- Cuando finalice el período del temporizador, retire rápidamente la solución de tinte FM y reemplácela con solución salina sin Ca2+ para detener el ciclo SV.
- Lavar en rápida sucesión con solución salina sin Ca2+ (5 veces durante 1 min) para asegurarse de que el tinte externo se elimine por completo.
- Mantenga la preparación larvaria en solución salina fresca libre de Ca2+ para obtener imágenes inmediatas con el microscopio confocal.
- Asegúrese de obtener una imagen de la fluorescencia del tinte FM1-43 en el mismo NMJ mencionado anteriormente utilizando los mismos ajustes confocal.
