Implantación de un electrodo en el núcleo subtalámico de una rata

Resumen

Fuente: Fluri, F., et al., Implantación de electrodos guiada por microelectrodos en el núcleo subtalámico de ratas para la estimulación cerebral profunda a largo plazo. J. Vis. Exp. (2015)

El video muestra un procedimiento para implantar un electrodo en el núcleo subtalámico de una rata para administrar estímulos eléctricos.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Anestesia

1. Revise el sistema anestésico para asegurar un suministro adecuado de gas (oxígeno) e isoflurano durante la duración del procedimiento. Conecte la nariz con la barra incisiva del instrumento estereotáxico y ajuste la barra incisiva a -3,3 mm.
2. Abra el gas de suministro (2 L/min). Coloca la rata en una caja y sella la parte superior. Enciende el vaporizador de isoflurano al 3,5%.
3. Cuando la rata esté recostada, cambie el sistema para que el gas anestésico fluya hacia el cono de la nariz, que está fijado a la barra incisiva.
4. Retira la rata de la cámara de la caja y afeita el área entre las orejas y los ojos; usando un bastoncillo de algodón empapado con Jodosept PVP, frota el área afeitada para eliminar el pelo suelto.
5. Colocar la rata en la nariz (Figura 1) y continuar la anestesia con isoflurano al 2,5% en_O2 (1 L/min). Compruebe el nivel de anestesia pellizcando la zona interdigital. Si la rata está anestesiada adecuadamente, los reflejos defensivos (es decir, la retirada del pie) quedan abolidos.
6. Controle la respiración y la respuesta a la estimulación durante el procedimiento y ajuste el vaporizador según sea necesario.
7. Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia. Un sistema de calefacción controlado por retroalimentación monitorea y mantiene la temperatura corporal a 37 ± 0,5 °C.

>2. Cirugía

1. Mantenga el campo quirúrgico estéril durante toda la cirugía. Una vez que las manos del cirujano y el campo quirúrgico estén estériles, muévase solo con cuidado y recuerde no romper la esterilidad. Esto incluye tener un campo estéril (por ejemplo, cortinas impermeables estériles) en el que se puedan colocar los instrumentos.
2. Inyecte 0,2 ml de mepivacaína por vía subcutánea en el centro de la zona afeitada. La mepivacaína es un anestésico local que tiene una duración de acción de hasta 3 horas. Anestesiará aún más el área quirúrgica.
3. Con un bisturí, haga una incisión en la línea media comenzando entre las orejas y extendiéndose hacia 2 cm. Asegúrese de que el periostio (membrana brillante debajo de la piel) también esté inciso. Exponga el cráneo con cuatro pinzas (Figura 2).
4. Con un bastoncillo de algodón, retire suavemente el periostio hasta que las suturas coronales y sagitales estén expuestas; a continuación, detenga la sangre con algodón.
5. Determine las coordenadas del bregma con una aguja fijada en un soporte de sonda y luego marque la punta de la aguja con un rotulador negro. Con los tornillos de accionamiento anterior/posterior (AP), de línea media/lateral (ML) y dorsoventral (DV), coloque la punta de la aguja directamente sobre el bregma.
6. Tome las lecturas de la escala de nonio AP y ML: reste 3,6 mm de la lectura AP y 2,5 mm de la lectura ML para la implantación de electrodos en el STN derecho, o agregue 2,5 mm para la implantación de electrodos en el STN izquierdo. Esta posición estará marcada por el tinte del rotulador después de bajar la punta de la aguja a la superficie del cráneo.
7. Sujete el taladro dental en el soporte de sonda grande del instrumento estereotáxico. Mueva el taladro dental al área calculada, es decir, al punto marcado en el cráneo. Mirando a través del microscopio, perfore un agujero (de aproximadamente 1 mm de diámetro) a través del cráneo hasta que la duramadre sea visible (el cráneo tiene aproximadamente 1 mm de grosor). Retraiga la duramadre con pinzas de microdisección o una aguja estéril. La duramadre es lo suficientemente dura como para destruir la punta del electrodo.
8. Taladre un orificio con el taladro dental en cada escama frontal y en la escama interparietal opuesta al orificio del electrodo. Desconecte el soporte de la sonda del instrumento estereotáxico. No perfore una sutura del cráneo, ya que los vasos venosos siguen las suturas debajo del cráneo.
9. Atornilla un tornillo de hueso en cada uno de los cinco agujeros. Evite enroscar los tornillos demasiado profundos. En el caso de los tornillos de acero inoxidable (M1.6), 2 o 3 vueltas del tornillo sujetarán adecuadamente el tornillo sin ejercer presión sobre el cerebro. El número de vueltas dependerá del paso del tornillo. Sujete el soporte de la sonda con el electrodo en el micromanipulador (Figura 3).
10. Con los tornillos de accionamiento AP, ML y DV, mueva el soporte de la sonda con el electrodo hasta que la punta esté casi tocando el bregma. Observe las lecturas de la escala vernier AP, ML y DV en el bregma. Cuando se realicen las lecturas, eleve el electrodo unos milímetros para evitar que el electrodo raspe el cráneo durante el movimiento. Para determinar las coordenadas de la posición en la que se debe insertar el electrodo en el orificio, agregue 3,6 mm a la lectura AP y agregue (o reste) 2,5 mm a la lectura ML.
11. Con los tornillos de accionamiento AP y ML, mueva el electrodo a la posición calculada. En este punto, la punta del electrodo debe situarse directamente sobre el orificio del electrodo perforado. Luego, mirando a través del microscopio, baje el electrodo hasta el nivel de la duramadre (Figura 4). Este nivel sirve como un nivel cero en la dirección DV. A continuación, inserte suavemente la punta del electrodo en el cerebro mirando a través del microscopio.
12. Conecte la clavija del electrodo al conector del sistema de grabación. Coloque una jaula de Faraday (o sustitúyala con papel de aluminio) sobre la rata en el instrumento estereotáxico (Figura 5). Conecte el instrumento estereotáxico con el contrapeso de la habitación en la que se está trabajando.
13. Inicie el sistema de grabación. Si está disponible, también use un altavoz para obtener una señal acústica de descargas/ungüentos de unidades individuales mientras avanza el electrodo.
14. Inserte lentamente el electrodo en el cerebro registrando la actividad eléctrica mientras avanza el electrodo. A una profundidad de entre 7,5 y 8,1 mm de la duramadre, la actividad eléctrica específica del STN suele ser detectable (Figura 6). La actividad típica de las neuronas en el STN se caracteriza por un patrón de disparo irregular y una alta tasa de disparo (frecuencia media: 40,9 ± 12,9 Hz).
15. Durante el registro, reduzca la anestesia tanto como sea posible (p. ej., a 0,8-1,0%); los animales con anestesia baja muestran una actividad cerebral eléctrica más clara.
16. Frote con un hisopo cualquier sangre o líquido cefalorraquídeo que se haya desplazado de la superficie del cráneo cuando se bajó el electrodo.
17. Mezcle una pequeña cantidad de cemento dental y aplíquelo alrededor del electrodo y alrededor de cuatro de los cinco tornillos con una espátula pequeña (Figura 7). El quinto tornillo se utilizará para fijar el cable de tierra del enchufe.
18. Desconecte la clavija del electrodo del portaelectrodos y conecte el sistema de registro cuando el cemento dental esté fijo.
19. Desatornille el tornillo que no fue fijado por cemento dental. Coloque el enchufe en la clavija del electrodo. Fije el cable de tierra del enchufe con el quinto tornillo (Figura 8).
20. Mezcla el cemento dental y aplícalo alrededor del tapón. A medida que el cemento se espesa, moldea alrededor del tapón para formar una tapa. Evite los bordes afilados del cemento dental que puedan dañar al animal y retírelos durante el endurecimiento (Figura 9A y B).
21. Desbrida los bordes de la herida y ciérralos con una sutura en la parte delantera y trasera del capuchón. Luego, desinfecte los bordes de la herida.
22. Conecte el enchufe de cabeza al cable que está fijado en un pivote. Retira la rata del instrumento estereotáxico.
23. Aplicar tramadol (12,5 mg/kg, por vía intraperitoneal) al final de la intervención y luego una vez al día durante 2-3 días. Coloque a la rata en una jaula limpia con soporte térmico, fije el eslabón giratorio en esta jaula (Figura 10) e inspecciónela cuidadosamente durante 1 hora.
24. No deje a un animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.

Resultados

Figura 1. Fijación de la cabeza en el instrumento estereotáxico. La rata se fija por las barras de la oreja del marco estereotáxico, así como por la máscara de anestesia gaseosa.

Figura 2. Exponiendo el cráneo. Después...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Electrodo Pt/Ir	FHC Inc.	UE	Hecho a medida: Especificación: UEPSEGSECN1M
Enchufes	GT Labortechnik (Arnstein/Alemania)
Encabezado de pin	DISTRELEC	143-95-324	Datamate 1x3 de una fila, 90°, tipo M80-8420342
enchufe	DISTRELEC	143-95-621	poste recto de una fila de 2 mm n.º 1x3 datamate, tipo M80-8400342
Muelle de acero inoxidable	Plásticos ONE	SS0102	# de parte: .120 X .156 Diámetro interior del resorte (mm): 3.0 Diámetro exterior del resorte (mm): 4.0
Cemento dental/Paladur	Heraeus Kulzer	64707938	Líquido, 500 ml
Cemento dental/Paladur	Heraeus Kulzer	64707954	Polvo, rosa, 500g
Tornillo de cabeza	Hummer y Reiss	V2ADIN84 M1.6x3
Jodosept JcJ	Vetoquinol		435678/E04
Mepivacaína 1%	AstraZeneca		PZN03338515
epinefrina	Sanofi-Aventis		PZN00176118
Clorhidrato de tramadol	Rotexmedica		38449.00.00