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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparando al animal:
- Anestesiar a la rata con un inhalante (isoflurano) al 1-2% administrado al efecto o por inyección (ketamina, xilacina, acepromazina). La dosis de anestesia inyectable es la siguiente: 95,0 mg/kg de ketamina, 10,0 mg/kg de xilacina, 0,075 mg/kg de acepromazina
nota: Utilizamos con éxito enfoques anestésicos inhalantes e inyectables al realizar este protocolo de registro CMAP, sin preferencia.
- El animal debe mantenerse a la profundidad anestésica adecuada antes de iniciar la cirugía, hasta la conclusión de la cirugía y hasta que la buprenorfina postoperatoria haya hecho efecto. Confirme la anestesia adecuada mediante un breve pellizco en el dedo del pie para determinar que no se provoca una respuesta de abstinencia. Además, pruebe el reflejo corneal con un hisopo de algodón. A lo largo del procedimiento quirúrgico, determine que la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria no han aumentado, lo que sugiere que la profundidad anestésica se ha vuelto demasiado ligera.
- Aplique ungüento veterinario en los ojos del animal para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
- El cirujano debe lavarse las manos con un desinfectante (exfoliante de clorhexidina) antes de comenzar la cirugía. El cirujano debe usar guantes estériles, una mascarilla y una bata o bata de laboratorio limpia. Todos los instrumentos deben lavarse y esterilizarse en autoclave antes de la cirugía. Agregue una tira indicadora de esterilización dentro del kit de instrumentos antes de esterilizar en autoclave a nivel de los instrumentos para verificar que la esterilización se haya completado. El cirujano debe verificar que toda la línea de la tira esté negra antes de comenzar la cirugía. Pega también el exterior de la caja con cinta indicadora de autoclave. Si la cirugía se va a realizar en varios animales el mismo día, limpie los instrumentos entre cirugías y esterilícelos en un esterilizador de perlas de vidrio. Si es necesario, esterilice ambos extremos del instrumento en el esterilizador de perlas de vidrio colocando el mango del instrumento en el esterilizador durante el tiempo adecuado, retirando el instrumento con un hemostático estéril, enfriándolo en un campo estéril y luego colocando el extremo funcional del instrumento en el esterilizador de perlas de vidrio durante el período apropiado.
- Una vez que el animal esté anestesiado, colóquelo en una tabla quirúrgica con la superficie dorsal hacia abajo y el abdomen hacia arriba para que la cinta pueda usarse para asegurar las extremidades delanteras del animal a la tabla quirúrgica.
- Afeitar la superficie ventral caudalmente comenzando en la base del cráneo y asegurarse de que el área alrededor del abdomen a ambos lados de la línea media esté afeitada dependiendo del hemidiafragma que se esté registrando. Aplique povidona yodada en la superficie afeitada de la piel.
>2. Preparación para las grabaciones CMAP:
- Después de la preparación del animal, coloque el electrodo de tierra por vía subcutánea en la cola (Figura 1).
- Coloque el electrodo de referencia por vía subcutánea en la región abdominal inferior contralateral.
- Coloque el gel conductor en la tira de superficie autoadhesiva o en el electrodo de registro de disco (dimensiones del electrodo de tira de superficie: 0,5 x 3 cm) y, a continuación, coloque el electrodo de superficie transversalmente a lo largo del margen costal unilateral.
- Colocar electrodos estimulantes por vía transcutánea a 0,5 cm de distancia, lateral a la tráquea y superior a la clavícula. Inserte los electrodos a aproximadamente 1,0 cm de profundidad a través de la piel. Asegure los electrodos con la mano para que su ubicación no se mueva con las estimulaciones posteriores.
nota: Electrodos estimulantes de ángulo de 90° con respecto a la piel en el lugar de inserción.
>3. Grabaciones del Potencial de Acción Muscular Compuesto (CMAP):
- Obtener registros electrofisiológicos utilizando un estimulador/amplificador seguido de análisis de datos asistido por ordenador.
- Los parámetros de estímulo de la estimulación de un solo tirón deben ser pulsos supramáximos de 0,5 mseg, 1,0 Hz. La amplitud del estímulo debe estar entre 6.0 y 8.0 V (Figura 2A).
nota: Dentro de un experimento, use una intensidad de estímulo con la misma amplitud en todos los animales. El objetivo es maximizar la amplitud de la respuesta utilizando la mínima amplitud de estimulación. Es importante tener en cuenta que la respuesta inicial que se produce en el momento de la estimulación es un artefacto de estimulación. Además, se debe tener cuidado de obtener una respuesta CMAP que esté precedida por una línea de base estable/plana después del artefacto de estimulación, que luego es seguida por la respuesta CMAP rápida. Para obtener dicha respuesta, puede ser necesario reposicionar los electrodos de estimulación y/o registro.
- Espere 30 segundos entre estimulaciones y repita 10 estimulaciones seguidas para obtener la respuesta promedio (Figura 2B-C). Mida la amplitud desde el inicio hasta el pico (Figura 2A). Llevar a cabo la estimulación del nervio frénico durante la fase del ciclo respiratorio del animal en la que el nervio frénico/diafragma no está activado. El procedimiento puede repetirse en el mismo animal para el semidiafragma contralateral.
- Después de la última sesión de registro de CMAP, perfundir al animal si se va a realizar una tinción de la unión neuromuscular del diafragma (NMJ). Realice registros CMAP repetidamente en el mismo animal aproximadamente una vez por semana (o en intervalos de su elección).
- Después de los registros de CMAP de supervivencia, permita que el animal se recupere en una almohadilla térmica de agua tibia circulante y monitoree continuamente durante la recuperación hasta que esté despierto y recostado severamente. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía a la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
- Una vez recostado severamente, vigile al animal cada 12 horas durante las primeras 48 horas (una vez al día a partir de entonces). Si el animal parece estar deshidratado (piel flácida, apatía), administrar líquidos (solución de ringers lactatos; por vía subcutánea; 1-2 ml por inyección, con los sitios rotados; 2 veces al día) hasta que se estabilice la pérdida de peso y líquidos postquirúrgica. Proporcione a los animales alimentos reblandecidos en platos pequeños durante el período postoperatorio agudo si es necesario para alentarlos a comer si no pueden alcanzar el comedero con tapa de barra de alambre.
- Administrar buprenorfina a una dosis de 0,05 mg/kg antes del final de la cirugía y luego a intervalos de 12 horas durante las primeras 24 horas (y dependiendo de los signos de dolor/estrés posteriores) mediante inyección subcutánea (sitio rotado). Si se notan signos de dolor o angustia posteriormente, trate a los animales con buprenorfina. Los signos indicativos de dolor/angustia incluyen falta de actividad, vocalizaciones, falta de comer o beber (deshidratación), pérdida de peso excesiva, protección, roer o rascarse excesivamente en el sitio de la incisión. Los criterios adicionales utilizados para determinar el dolor y la angustia incluyen la falta de respuesta a estímulos extraños, la vocalización transitoria o no provocada, la respiración dificultosa o anormal, la secreción naso-occular persistente de color marrón rojizo, la piloerección marcada. También monitoree la evidencia de mala higiene que sugeriría animales enfermos. Si se observa que el animal todavía está en peligro después de 72 horas de tratamiento (de acuerdo con los criterios de dolor/estrés descritos anteriormente, y después de recibir el protocolo analgésico descrito anteriormente), eutanasiar al animal.
