in vivo Imágenes de calcio utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en Drosophila melanogaster

Resumen

Fuente: Hancock, C. E. et al., Imágenes de calcio óptico in vivo de la plasticidad sináptica inducida por el aprendizaje en Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un método para obtener imágenes de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en moscas. Describe los pasos para preparar las moscas para la microscopía, realizar el acondicionamiento olfativo y visualizar la afluencia de calcio inducida por el olor.

Protocolo

>1. Moscas de la fruta transgénicas, Drosophila melanogaster

1. Cruce de moscas hembras vírgenes y machos (criadas a 25 °C con un 60% de humedad relativa en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h) portadoras de las construcciones Gal4 y UAS deseadas, respectivamente, para producir moscas en las que neuronas específicas de interés expresan un indicador de calcio codificado genéticamente.
2. Envejezca la progenie femenina de la cruz anterior hasta que estén en el rango de 3 a 6 días después de la eclosión. Las moscas hembra son preferibles debido a su tamaño ligeramente más grande.

>2. Preparación de la mosca de la fruta para la obtención de imágenes de calcio in vivo

1. Seleccione una sola mosca hembra y anestesiar en hielo durante no más de 5 minutos.
2. Con pinzas finas, coloque la mosca en la cámara de imágenes (como se muestra en la Figura 1c). Asegúrese de que el tórax y las patas estén en contacto con los cables eléctricos en la parte inferior de la cámara y que la cabeza quede plana. Fije la posición de la mosca con cinta adhesiva transparente.
   nota: Este protocolo requiere una cámara hecha a medida en la que se fijan las moscas, con la cápsula de la cabeza accesible para su apertura, y las moscas pueden recibir tanto estímulos de olor en las antenas como descargas eléctricas en el tórax y las patas (Figura 1).
3. Usando una hoja de bisturí quirúrgico fijada al mango del bisturí (ver Tabla de Materiales), corte una ventana en la cinta alrededor de la cabeza de la mosca, dejando las antenas cubiertas y solo la parte más anterior del tórax expuesta.
4. Rodea los lados y la parte posterior de la cabeza con pegamento de curado con luz azul, cuidadosamente manipulado con un alfiler de insecto sostenido por mandíbulas cóncavas-convexas. Fije el pegamento con una lámpara LED emisora de luz azul.
5. Verifique que el pegamento esté completamente fraguado y elimine cualquier residuo de pegamento sin endurecer de la superficie dorsal de la cabeza de la mosca.
6. Aplique una gota de solución de Ringer (ver Tabla de Materiales) para cubrir la cutícula expuesta de la cabeza.
7. Con un cuchillo de hoja muy fina, corte la cutícula. Para la eliminación más eficiente de la cutícula, primero corte a través de la parte posterior de la cabeza usando los ocelos como punto de partida. Luego, corte cada lado, medial a los ojos, para formar una solapa de la cutícula que se pueda arrancar fácilmente con pinzas.
8. Retire cualquier exceso de cutícula que pueda bloquear la región del cerebro de interés.
9. Limpie cuidadosamente la superficie dorsal de cualquier tráquea con pinzas finas, evitando la interrupción del tejido cerebral en sí. Retire y refresque la solución de Ringer (consulte la Tabla de materiales) según sea necesario para limpiar el área de restos de tejido.
10. Coloque la aguja de liberación de olor hipodérmico en una posición aproximadamente a 1 cm de la cabeza de la mosca. Asegúrese de que no haya nada que pueda obstruir la entrega de olores a las antenas.
11. En el microscopio, conecte la cámara de imágenes al sistema de suministro de olores a través de la aguja de suministro de olores hipodérmicos.
12. Para permitir que la mosca se recupere completamente de la anestesia y la cirugía, y para adaptarse al flujo de aire, implemente un período de descanso de 10 minutos en esta etapa.

3. Imágenes de calcio in vivo

1. Utilice un microscopio multifotónico equipado con un láser infrarrojo y un objetivo de inmersión en agua (ver Tabla de Materiales), instalado sobre una mesa aislada de vibraciones. Para la visualización de indicadores de calcio basados en proteínas fluorescentes verdes (GFP), ajuste el láser a una longitud de onda de excitación de 920 nm e instale un filtro de paso de banda GFP.
2. Con la perilla de ajuste Z gruesa, escanee el eje Z del cerebro y localice la región cerebral de interés. Utilice la función de recorte para enfocar el escaneo solo en esta área para minimizar el tiempo de escaneo y rotar la vista de escaneo de modo que la parte anterior de la cabeza quede hacia abajo.
3. Ajusta el tamaño del fotograma a 512 x 512 px, la velocidad de escaneo a > 4 Hz y la región de escaneo (en la dimensión Y) para que las neuronas de interés estén cubiertas.

>4. Visualización de transitorios de calcio evocados por olores a través del condicionamiento olfativo

1. Utilice un sistema de entrega de olores que pueda entregar varios estímulos de olor de una manera temporalmente precisa.
   1. Utilice una computadora adicional para controlar el dispositivo y comunicarse con el software del microscopio de imágenes para coordinar las estimulaciones de olores con la captura de imágenes durante los experimentos.
   2. Inicie un paquete de macros preprogramado capaz de vincular el software de adquisición de imágenes y el programa de entrega de olores (por ejemplo, un paquete de macros VBA instalado en el software de control del microscopio, consulte la Tabla de materiales) que responde a un disparador de entrada externo proporcionado por el inicio de un protocolo de entrega de olores en un programa separado).
2. Comience la medición monitoreando los transitorios de calcio evocados por olores "previos" / ingenuos a una resolución de 512 x 512 px y una velocidad de fotogramas de 4 Hz. Proporcione un estímulo de olor de 2,5 s flanqueado por una adquisición de imágenes adicional durante 6,25 s antes del inicio del olor (para establecer un valor de referencia de F₀) y 12,5 s después de la compensación de olores. Repita esto con un segundo odorante y luego con un tercer odorante.
3. Continúe 3 minutos después de esta medición con el acondicionamiento clásico ("entrenamiento") de la mosca.
   1. Seleccione uno de los olores presentados en la fase de "pre-entrenamiento" para que se convierta en el olor del estímulo condicionado (CS+) y otro para que se convierta en el olor CS^-. Presente el olor CS⁺ utilizando el sistema de entrega de olores controlado por computadora durante 60 s junto con doce descargas eléctricas de 90 V.
   2. Después de un descanso de 60 s, presente el olor CS solo durante 60 s. Use como odorantes 4-metilciclohexanol y 3-octanol. No presente el tercer odorante (por ejemplo, 1-octen-3-ol) durante este entrenamiento, ya que se utiliza como control solo antes (paso 4.2.) y después (paso 4.4) de la fase de entrenamiento.
4. Mida nuevamente los transitorios de calcio evocados por el olor "post-entrenamiento" repitiendo el protocolo de estimulación de olores "pre-entrenamiento" (paso 4.2.) 3 min después de terminar la fase de entrenamiento (paso 4.3).
   nota: El momento de este paso debe reflejar el tiempo de interés después de la formación de la memoria (por ejemplo, realizar este paso 3-4 minutos después del paso de condicionamiento para investigar la memoria a corto plazo). Por lo general, las moscas pueden sobrevivir durante varias horas en esta preparación.
5. Guarde los archivos de imagen en un formato adecuado (por ejemplo, Tiff) para su posterior análisis de imágenes.

5. Análisis de imágenes

1. Para analizar imágenes, abra archivos Tiff (o similares) en el software de análisis de imágenes como Fiji.
2. Alinee las pilas mediante un algoritmo de corrección de movimiento para garantizar un movimiento mínimo en las direcciones X e Y. Descarte cualquier grabación que muestre un movimiento fuerte en el eje Z.
3. Seleccione la herramienta de software utilizada para marcar una región de interés (ROI) alrededor del área que se va a examinar. Esto debe ser lo más preciso posible para limitar la influencia de la fluorescencia de fondo.
4. Utilice la herramienta de software respectiva para extraer los datos de intensidad de fluorescencia temporal como archivos de datos del ROI seleccionado, de modo que se genere un valor para cada fotograma de la grabación.
5. Abra los datos utilizando un programa de análisis de datos para calcular los valores ΔF/F₀ para cada rastro de olor. F₀ = fluorescencia media en los 2 s anteriores al inicio del olor. ΔF = la diferencia entre la fluorescencia bruta en un marco dado y F₀. A partir de estos valores, calcule un valor ΔF/F₀ para cada fotograma, que se puede trazar en función del tiempo para reflejar la fluorescencia relativa durante todo el período de estímulo del olor.

Resultados

Figura 1: Construcción de una cámara de montaje y preparación de una mosca para la obtención de imágenes.a) Pasos para la construcción de la cámara de montaje de moscas. La base está formada por un portaobjetos de microscopio estándar (1) cubierto con una fina malla de plástico (2). Dos cables eléctricos que transportan cargas opuestas (3) están pegados a la corredera a cada lado. Lo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	O5284	Producto químico utilizado como odorante
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	218405	Producto químico utilizado como odorante
4-Metilciclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	153095	Producto químico utilizado como odorante
Filtro de paso de banda para EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania
Cinta adhesiva transparente	Tesa SE, Norderstedt, Alemania		Cinta adhesiva transparente estándar
Mandíbulas cóncavas-convexas	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	10053-09	Portacuchillas con mordazas cóncavas-convexas
Pinzas finas	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	11412-11	Pinzas con punta de 0,1 x 0,06 mm
aguja hipodérmica	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Alemania	4665120	1,20x40mm
Alfileres de minucias de insectos	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	26002-10	Diámetro 0,1 mm, punta 0,0125 mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, Reino Unido	953683	Pegamento fotopolimerizable azul
Portaobjetos de microscopio	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemania	Artículo 656.1	Corredera de objetivo estándar 76 x 26 mm
Aceite mineral	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	M8410	Se utiliza como diluyente para odorantes
Láser Ti-Sapphire con bloqueo de modo Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, EE. UU.		Láser de femtosegundo infrarrojo sintonizable
Microscopio multifotónico LSM 7MP equipado con detectores BiG	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania		Microscopio multifotónico, varias empresas proporcionan dispositivos similares.
Objetivo de inmersión en agua Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania	421452-9900-000	Objetivo W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
La solución de Ringer	N.D.	N.D.	5 mM de KCl, 130 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 5 mM de Hepes-NaOH, 36 mM de sacarosa, pH = 7,4
Cuchillo de apuñalamiento	Sharpoint, Corporación de Especialidades Quirúrgicas, Reading, PA, EE. UU.	72-1551	Profundidad de hoja recta restringida de 5,0 mm
Hoja de bisturí quirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	Artículo 303	N.º de producto 11
Mango de bisturí quirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	907	N.º de producto 7S/S
Software Visual Basics of Applicatons (VBA) para recibir un disparador del dispositivo de entrega de olores y el dispositivo de aplicación de descargas eléctricas (fuente de alimentación) para interactuar con el software ZEN de Zeiss que controla el microscopio.	Escrito a medida y disponible a pedido	N.D.	N.D.