in vivo Imágenes de calcio utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en Drosophila melanogaster

Resumen

Fuente: Hancock, C. E. et al., Imágenes de calcio óptico in vivo de la plasticidad sináptica inducida por el aprendizaje en Drosophila melanogaster.J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un método para obtener imágenes de calcio in vivo utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en moscas. Describe los pasos para preparar las moscas para la microscopía, realizar el acondicionamiento olfativo y visualizar la afluencia de calcio inducida por el olor.

Protocolo

>1. Moscas de la fruta transgénicas, Drosophila melanogaster

1. Cruce de moscas hembras vírgenes y machos (criadas a 25 °C con un 60% de humedad relativa en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h) portadoras de las construcciones Gal4 y UAS deseadas, respectivamente, para producir moscas en las que neuronas específicas de interés expresan un indicador de calcio codificado genéticamente.
2. Envejezca la progenie femenina de la cruz anterior hasta que estén en el rango de 3 a 6 días después de la eclosión. Las moscas hembra son preferibles debido a su tamaño ligeramente más grande.

>2. Preparaci....

Resultados

Figura 1: Construcción de una cámara de montaje y preparación de una mosca para la obtención de imágenes.a) Pasos para la construcción de la cámara de montaje de moscas. La base está formada por un portaobjetos de microscopio estándar (1) cubierto con una fina malla de plástico (2). Dos cables eléctricos que transportan cargas opuestas (3) están pegados a la corredera a cada lado. Lo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	O5284	Producto químico utilizado como odorante
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	218405	Producto químico utilizado como odorante
4-Metilciclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	153095	Producto químico utilizado como odorante
Filtro de paso de banda para EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania
Cinta adhesiva transparente	Tesa SE, Norderstedt, Alemania		Cinta adhesiva transparente estándar
Mandíbulas cóncavas-convexas	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	10053-09	Portacuchillas con mordazas cóncavas-convexas
Pinzas finas	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	11412-11	Pinzas con punta de 0,1 x 0,06 mm
aguja hipodérmica	Sterican - B. Braun, Melsungenk, Alemania	4665120	1,20x40mm
Alfileres de minucias de insectos	Fine Science Tools, North Vancouver, Canadá	26002-10	Diámetro 0,1 mm, punta 0,0125 mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, Reino Unido	953683	Pegamento fotopolimerizable azul
Portaobjetos de microscopio	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Alemania	Artículo 656.1	Corredera de objetivo estándar 76 x 26 mm
Aceite mineral	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	M8410	Se utiliza como diluyente para odorantes
Láser Ti-Sapphire con bloqueo de modo Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, EE. UU.		Láser de femtosegundo infrarrojo sintonizable
Microscopio multifotónico LSM 7MP equipado con detectores BiG	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania		Microscopio multifotónico, varias empresas proporcionan dispositivos similares.
Objetivo de inmersión en agua Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemania	421452-9900-000	Objetivo W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
La solución de Ringer	N.D.	N.D.	5 mM de KCl, 130 mM de NaCl, 2 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 5 mM de Hepes-NaOH, 36 mM de sacarosa, pH = 7,4
Cuchillo de apuñalamiento	Sharpoint, Corporación de Especialidades Quirúrgicas, Reading, PA, EE. UU.	72-1551	Profundidad de hoja recta restringida de 5,0 mm
Hoja de bisturí quirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	Artículo 303	N.º de producto 11
Mango de bisturí quirúrgico	Swann-Morton, Sheffield, Reino Unido	907	N.º de producto 7S/S
Software Visual Basics of Applicatons (VBA) para recibir un disparador del dispositivo de entrega de olores y el dispositivo de aplicación de descargas eléctricas (fuente de alimentación) para interactuar con el software ZEN de Zeiss que controla el microscopio.	Escrito a medida y disponible a pedido	N.D.	N.D.