Neuromodulación inducida por ultrasonidos mediante un sistema de matriz de microelectrodos

Abstract

Fuente: Liang, R. et al., Neuromodulación ultrasónica focalizada de cultivos neuronales in vitro humanos en matrices de microelectrodos multipocillo. J. Vis. Exp. (2024)

Este video demuestra el método para inducir la modulación de la actividad neuronal en neuronas humanas cultivadas derivadas de iPSC en una matriz de microelectrodos de múltiples pocillos, o sistema MEA utilizando un transductor de ultrasonido enfocado.

Protocol

1. Preparación de materiales

1. Aspire el medio de cultivo y utilícelo para llenar un solo pocillo en una placa de cultivo de neuronas de 24 pocillos con una matriz de microelectrodos (MEA) integrada (Figura 1A).
2. Esterilizar la interfaz del parafilm, la banda elástica y el cono de ultrasonido focalizado (FUS) con su membrana de goma utilizando etanol al 70% durante 10 min, y colóquelos en la campana de gases para su posterior montaje.
3. Desgasificar 300 mL de agua desionizada y 50 mL de gel de acoplamiento. Centrifugar el agua y el gel a 160 x g durante 5 min para evitar inducir cavitación dentro del medio de acoplamiento.
   nota: La fuente original de las células madre pluripotentes inducidas humanas (HiPSC) proviene de las líneas celulares GM01582 y CIPS. En promedio, se puede lograr una densidad de 5 x 10⁴ neuronas motoras y 2,5 x^{10 4} astrocitos por pocillo.

>2. Conexión y configuración de los periféricos

1. Fije el cono FUS al transductor con tornillos y selle el cono con una membrana de goma flexible en una capucha estéril ventilada. Llene el cono con el agua desgasificada y desionizada (DG-DI) del paso 1.3 y asegúrese de que no haya burbujas en el cono para evitar la cavitación.
2. Utilice una varilla roscada personalizada para asegurar el soporte impreso en 3D a un marco (Figura 1B). Coloque el marco de manera que la cabeza del transductor FUS quede sobre el pocillo que se estimulará.
3. Utilice una banda elástica para asegurar el parafilm sobre el pocillo en la placa MEA de 24 pocillos que contiene el medio y los HiPSC.
4. Prepare el sistema FUS conectando la electrónica del controlador del transductor de ultrasonidos, en este caso, la salida de potencia del transductor (TPO), a una toma de corriente de 100-240 V y conectando la red correspondiente al TPO y al transductor FUS. La red correspondiente garantiza un acoplamiento eléctrico eficiente entre el transductor y el TPO.
5. Conecte el sistema MEA a una toma de corriente (100-240 V) (Figura 2B, Conexión 5). Conecte el puerto de sincronización del sistema MEA al TPO (Figura 2B, Conexión 3). Esta conexión sincronizará la adquisición de datos por el sistema MEA con la estimulación FUS.
6. Coloque la placa MEA de 24 pocillos en el sistema MEA y retire la tapa para permitir el contacto directo entre el transductor y el pocillo. Coloque el transductor 5-10 mm por encima de la placa del pocillo para dejar espacio para el gel de acoplamiento desgasificado, como se describe en el paso 3.2 (Figura 2A y Figura 1B).

>3. Estimulación y adquisición de señales neuronales

1. Configure los parámetros FUS en el panel de control TPO (Tabla 1).
2. Aplique el gel de acoplamiento en la parte superior del parafilm y baje el transductor FUS en el gel de acoplamiento, asegurando el contacto con el gel con un mínimo de burbujas de aire (Figura 1A).
3. Inicie la grabación del sistema MEA haciendo clic en el botón Iniciar en la interfaz de usuario.
4. Inicie la sonicación FUS pulsando el botón inferior derecho del TPO (Figura 2A, Etiqueta 7), y espere al menos 5 minutos entre cada ronda de sonicación para permitir que las neuronas vuelvan a un estado de referencia.
5. Utilice el pulso de disparo generado por el sistema FUS para alinear la secuencia de estimulación FUS con el registro MEA (Figura 1B, Conexión 3).

Tabla 1: Parámetros de ultrasonido focalizado (FUS) establecidos en el TPO

parámetro	valor
Potencia máxima/canal	1.200 W
Hechos	0,749 W/canal
ISPPA	10,79 W/cm2
ISPTA	0,05 W/cm2
Longitud de ráfaga	0,100 ms
frecuencia	250.00 kHz
centro de atención	39.800 milímetros
periodo	20.000 ms
temporizador	60.000 s

Results

Figura 1: Neuromodulación FUS con una matriz de microelectrodos (MEA) de pocillos múltiples. (A) Esquema de la configuración para la neuromodulación FUS con un MEA de pocillos múltiples. Las ondas acústicas generadas por el transductor FUS se propagan a través de un cono FUS lleno de agua desgasificada y se acoplan mediante gel de ultrasonidos. El parafilm se asegura al pozo mediante...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema MEA	Axion Biosystem Inc.	Borde del Maestro	Frecuencia de muestreo: 11500 Hz
Placa MEA	Axion Biosystem Inc.	CytoView MEA	Electrodo y pocillo: 16 electrodos en 24 pocillos
Interfaz de placa de pozo	Amcor Inc.	Parafilm PM996; Página 7793	Espesor: 127 μm
Tanque de CO2 y regulador para cultivo	AirGas Inc./ Harris Inc.	9296NC	Concentración: 5%
Medios de Cultura	ThermoFisher Inc.	Laminina; 23017-015	Concentración: 1 μg/mL
Neuronas HiPSC	Peprotech	CIPS y GM01582 derivados; 450-10	Concentración: 10 ng/mL (Consultar Taga et al [2021]13)
transductor	Conceptos Sónicos Inc.	CTX250; 008	Frecuencia central: 250 kHz
Red de coincidencia	Conceptos Sónicos Inc.	CTX250; NFS102v2	Impedancia: 50 Ω
Salida de potencia del transductor (TPO)	Conceptos Sónicos Inc.	Versión 4.1; 020	Frecuencia: De 250 kHz a 2,5 MHz
membrana	McMaster Inc.	Caucho de silicona; 5542N115	Grosor: 0,0127 cm
Gel de acoplamiento	Laboratorio Parker Inc.	Aquasonic 100; B08DDWG GXB	Viscosidad: 130.000–185.000 cops
Conexión al soporte de la sonda	McMaster Inc.	Varilla roscada de robo; 90322A661	Longitud: 1–1/2" de largo
hidrófono	Conceptos Sónicos Inc.	Y-104; 009	Rango: 50 kHz–1,9 MHz
Tanque de agua	Conceptos Sónicos Inc.	Wt	Tamaño: 30 cm x 30 cm x 30 cm
Unidad de Aire Acondicionado	Conceptos Sónicos Inc.	WCU; SN006	Velocidad de flujo: 50 mL/s máximo
osciloscopio	Rohde-Schwarz Inc.	RTC1002	Frecuencia de muestreo: Hasta 50 MHz
etapa	Conceptos Sónicos Inc.	MicroStage; 2	Precisión: 1 μm
Lámina termocrómica	TIPTEMP Inc.	Lámina de cristal líquido; TLCSEN337	Rango: 22–24 °C
ordenador	Microsoft Surface	Surface Pro	CPU i5 1035G4: 3,7 GHz
Software de transferencia de datos	Mathworks Inc.	MATLAB	Versión 2021b
Software de procesamiento	Fundación de software Python	pitón	Versión 3.7.10