1. Configuración previa a las grabaciones
- Prepare las soluciones de registro con concentraciones de iones como se indica en la Tabla 1.
- Prepare 15 mL de soluciones madre de 2 M en agua ultrapura para MgCl2, CaCl2, KCl y CsCl.
- Pesar los componentes sólidos de 100 mL de las soluciones tamponadas intracelulares y 500 mL de las soluciones tamponadas extracelulares de acuerdo con la Tabla 1 en vasos de precipitados separados y añadir posteriormente la cantidad respectiva de las soluciones madre preparadas. Por ejemplo, para el tampón intracelular, use 0,3803 g (10 mM) de EGTA (ácido tetraacético de etilenglicol), 0,2383 g (10 mM) de ácido HEPES(4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico) y 0,6428 g (110 mM) de NaCl y agregue 100 μL de las soluciones madre de 2 M MgCl2 y CaCl2 y 50 μL de las soluciones madre de KCl y CsCl 2 M.
- Agregue agua ultrapura y ajuste cuidadosamente el pH usando ácidos y bases, que no interfieran con la medición, es decir, que no sean conducidos por el ChR (Channelrodopsinas), como el ácido cítrico y la N-metil-D-glucamina (NMG+).
- Ajustar la osmolaridad a 290 mOsm para las soluciones intracelulares y a 320 mOsm para las extracelulares con glucosa.
nota: Las soluciones intracelulares ligeramente hipoosmóticas aumentan la tasa de éxito de los parches.
- Filtre todas las soluciones estériles a través de filtros de 0,22 μm. Almacene las soluciones a 4 °C durante dos semanas o congele a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.
- Calcular los potenciales de unión líquida y preparar protocolos de registro.
NOTA: El cambio en la concentración de cloruro extracelular después de establecer la configuración de la célula completa provoca un potencial de unión líquida (LJP) significativo que debe corregirse. Los LJP se pueden medir o calcular directamente, aquí se utiliza esta última opción. En este protocolo, se utilizará la corrección en línea, exigiendo un protocolo de registro para cada búfer externo. Sin embargo, para un conjunto más grande de soluciones externas, se recomienda una postcorrección de LJP para evitar falsas correcciones.
- Abra la calculadora de potencial de unión (JPC) y abra el cuadro de diálogo 'Nuevo experimento'. A continuación, seleccione "Medidas de la abrazadera de parche". Seleccione "Mediciones de celda completa" y "Electrodo de solución salina estándar" e introduzca una temperatura de 25 °C. Entre cada paso, avance aceptando la selección pulsando el botón "siguiente".
NOTA: Los experimentos se realizan a una temperatura ambiente de 25 °C en un laboratorio con aire acondicionado. Asegúrese de que las soluciones tampón tengan temperatura ambiente antes de comenzar los experimentos. Para variar la temperatura de la muestra, se puede utilizar una etapa o cámara de incubación. La temperatura del baño se puede medir frecuentemente con un termómetro.
- Agregue todas las concentraciones individuales de aniones y cationes de la solución pipeteada y el tampón con alto contenido de cloruro de acuerdo con las concentraciones enumeradas en la Tabla 1.
nota: El JPC calculará un LJP de -0,5 mV para las condiciones de arranque.
- Haga clic en "Nueva solución de baño" para ingresar la composición aniónica y catiónica del tampón con bajo contenido de cloruro.
nota: El JPC calculará ahora un nuevo LJP de +12,6 mV de acuerdo con la solución de registro extracelular modificada.
- Prepare dos protocolos corregidos por LJP para las dos condiciones de medición restando el LJP calculado del potencial de retención aplicado; -0,5 mV para las soluciones externas de alto y +12,6 mV para las soluciones externas de bajo cloruro. Por lo tanto, los protocolos comienzan con -79,5 mV (alto cloruro) y -92,6 mV (bajo cloruro), respectivamente para obtener un potencial de retención inicial corregido por LJP de -80 mV en ambos casos
nota: Los siguientes pasos se aplican al software de adquisición de datos mencionado en la lista de materiales.
- Abra el editor de protocolos en el software de adquisición. En el menú "Modo", selecciona "Estimulación episódica" e incluye 7 barridos.
- Cambie al menú "Forma de onda" en el editor e incluya un período de 200 ms con un potencial de retención de 0 mV seguido de un período de 2 s con un potencial de retención variable a partir de -79,5 mV para alto cloruro. Incluya un "nivel Delta" de 20 mV para el segundo período para aumentar el potencial de retención en 20 mV en cada barrido.
- Dentro de los pasos de voltaje del editor de forma de onda, aplique un período de iluminación de 500 ms con luz de 540 nm (3,10 mW/mm²). Para ello, cambie el "patrón de bits digitales" del obturador conectado que controla la fuente de luz para que esté activo 500 ms después del segundo período descrito anteriormente (véase 1.2.6).
nota: La intensidad de la luz puede influir en las propiedades biofísicas de las corrientes de canal, como la amplitud o la inactivación. Por lo tanto, siempre se deben informar las densidades de potencia luminosa. Para medir la potencia de la luz después de pasar por todas las ópticas y el cubreobjetos, utilice un optómetro calibrado. Para calcular la densidad de potencia, determine el campo iluminado del objetivo por un micrómetro de objeto y divida la potencia de luz medida por el campo iluminado determinado.
- Guarde el protocolo para la solución extracelular con alto contenido de cloruro. Modifique el protocolo y reemplace el potencial de retención de primer nivel por -92,6 mV (cloruro externo bajo). Guarde este segundo protocolo para medir la condición extracelular de bajo cloruro.
- Recubrimiento de lisina de cubreobjetos de vidrio según protocolo adaptado.
- Coloque varios 100 cubreobjetos en una placa de Petri de vidrio y agregue 250 mL de HCl (1 N).
- Coloque la placa de Petri con los deslizamientos de la tapa en un agitador lineal. Agitar a 120 rpm durante 72 h para limpiar los cubreobjetos, y después, enjuagar con agua ultrapura para neutralizar el pH.
- Remojelos en un pequeño volumen de etanol al 95% para su posterior limpieza.
NOTA: Los cubreobjetos limpios se pueden almacenar en etanol al 70% antes de continuar. Trabaje bajo una campana de flujo laminar para los siguientes pasos.
- Con un mechero Bunsen y unas pinzas, flamee cada cubreobjetos y transfiéralo a una nueva placa de Petri.
- Incubar los cubreobjetos de vidrio con una solución estéril de poli-D-lisina de 50 μg/mL durante al menos 1 h (o toda la noche) a temperatura ambiente mientras se agita con un agitador lineal a 150 rpm.
- Lave los cubreobjetos con agua ultrapura para eliminar el exceso de poli-D-lisina.
- Extienda los cubreobjetos sobre papel estéril para que se sequen durante 10 minutos y expóngalos a la luz UV (ultravioleta) para su esterilización (al menos 20 minutos).
- Recoja los cubreobjetos en una placa de Petri estéril cubierta con papel de aluminio hasta su uso.
- Preparar el ADN del gen PsACR1 fusionado con mCherry utilizando técnicas estándar de biología molecular.
- Clone la secuencia génica optimizada para codón humano que codifica PsACR1 en un plásmido peGFP-C1 (promotor de CMV (Cytomegalovirus), resistencia a la kanamicina) en un marco con el fluoróforo mCherry utilizando enzimas de restricción u otros métodos de clonación establecidos.
Nota: También se pueden usar otros fluoróforos, pero asegúrese de tener a mano los juegos de filtros correspondientes para observar su fluorescencia bajo el microscopio en la configuración.
- Transformar el ADN plasmídico en células de E. coli XL1Blue quimiocompetentes mediante choque térmico según el protocolo estándar y colocarlas en placas de agar (30 μg/mL de kanamicina). Cultive las bacterias en placa durante la noche a 37 °C.
- Al día siguiente, inocular 4 mL de medio de caldo de lisogén suplementado con 30 μg/mL de kanamicina con células de colonias individuales e incubarlas durante la noche a 37 °C y 180 rpm en una incubadora.
- Después de la incubación durante la noche, purifique el ADN plásmido de los cultivos utilizando un kit disponible comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Siembra las células
NOTA: Realice los pasos bajo una campana de flujo laminar.
- Coloque hasta tres cubreobjetos de vidrio recubiertos de lisina uno al lado del otro en una placa de Petri de 35 mm.
nota: Presiónelos suavemente contra el fondo del plato para evitar que se deslicen entre sí.
- Siembre 1,5 x 105 células HEK (células embrionarias de riñón humano) en 2 mL estándar de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado con un 10 % de suero fetal bovino (FBS) en cada plato.
- Suplementar con retinal totalmente trans a una concentración final de 1 μM. Cultive las células durante al menos un día antes de continuar con el paso 1.6.
- Transfectar transitoriamente las células a través de la lipofección.
- Para cada placa de células, prepare una solución de 2 μg de ADN plasmídico (ácido desoxirribonucleico) en 250 μL DMEM sin FBS y 6 μL de reactivo de transfección.
- Después de 15 minutos de incubación, agregue suavemente (gota a gota) la solución a las células.
- Preparar puentes de agar
- Añadir 0,75 g de agarosa a 50 mL de solución estéril de cloruro sódico (140 mM) y disolverla calentándola en microondas.
NOTA: 2 - 3 M de KCl para la preparación del puente de agar reduce aún más el LJP debido a la mayor concentración (por ejemplo, difusión constante desde el puente) y la igual movilidad de los iones K+ y Cl-, pero se evitó para minimizar la fuga de iones (especialmente Cl-) en la solución del baño.
- Llene 10 μL de puntas de pipeta (o una manguera de diámetro pequeño) con la solución líquida de agarosa con una jeringa.
nota: Evite las burbujas de aire en el puente.
- Una vez que los puentes de agar se hayan enfriado y solidificado, guárdelos en una solución estéril de cloruro de sodio de 140 mM.
- Prepare los electrodos de grabación y baño.
- Retire los alambres de plata del baño y del electrodo de registro de la configuración de la abrazadera de parche.
- Pule los cables con papel de lija para eliminar el cloruro de plata de experimentos anteriores. Sumerja el cable de plata limpio en 3 M KCl y conéctelo al polo positivo de una batería de 1,5 V para el recubrimiento electrolítico con cloruro de plata.
NOTA: Se puede utilizar una fuente de alimentación de laboratorio en lugar de una batería.
- Extraiga pipetas de parche de baja resistencia (1,5-3,0 MΩ) de los capilares de vidrio con un extractor de micropipetas y pula al fuego. Guarde las pipetas sin polvo para el día de la medición.
- Encienda todos los componentes de configuración para que se calienten hasta la temperatura de trabajo 30 minutos antes de las grabaciones. Asegúrese de que los tampones estén a temperatura ambiente.
>2. Mediciones de selectividad
- Iniciar las grabaciones de 24 a 48 h después de la transfección transitoria de las células.
- Coloque un cubreobjetos en la cámara de medición y séllelo con silicona para evitar fugas del tampón externo. Guarde la placa de Petri con los otros cubreobjetos en una incubadora para el próximo conjunto de experimentos.
- Llene cuidadosamente la cámara con tampón extracelular (alto [Cl-]) para evitar el desprendimiento de células, luego colóquela bajo el microscopio y use el objetivo 40X para visualizar las células.
- Coloque un puente de agar sobre el electrodo de baño y colóquelo en la cámara junto con el sensor de nivel de líquido y la salida de perfusión del manipulador de baño.
- Cambie la solución extracelular dos veces con 1 mL de solución externa fresca (alto [Cl-]) para eliminar el medio de cultivo residual y las células desprendidas.
- Enfocar las células y buscar una célula transfectada (fluorescente), que debe aislarse de otras células. Utilice un conjunto de filtros de triple banda y luz naranja (590 nm; ancho de banda 15 nm; 100% de intensidad) para excitar y visualizar mCherry.
nota: Las celdas HEK se pueden acoplar eléctricamente a sus vecinas mediante uniones de separación, lo que da como resultado una baja resistencia de membrana en la configuración de celda completa.
- Llene una de las pipetas extraídas con solución intracelular y elimine las burbujas de aire volteando la pipeta varias veces.
- Monte la pipeta en el soporte de la pipeta y aplique un poco de presión positiva para evitar la obstrucción de la punta.
- Localice la punta de la pipeta de parche bajo el microscopio y desplácela cerca de la célula utilizando el micromanipulador.
nota: Los siguientes pasos se aplican al amplificador, al software de adquisición de datos y de evaluación mencionado en la lista de materiales.
- Inicie la "prueba de membrana" en el software de adquisición de datos y aplique un paso de voltaje (pulso de prueba; por ejemplo, 5 mV durante 10 ms, línea de base a 0 mV), manual o automáticamente a través del software especificado utilizando el "modo de baño" mientras se ejecuta la "prueba de membrana" en el software de adquisición de datos.
- Compruebe que la resistencia de la pipeta esté en el rango deseado (1,5-3,0 MΩ).
- Corrientes de compensación cero ajustando el potencial de la pipeta girando la perilla de compensación de la pipeta en el amplificador mientras se trabaja en el "modo de baño" de la "prueba de membrana".
- Establezca un parche en la configuración de celda completa.
NOTA: Los siguientes pasos requieren la aplicación de presión positiva y negativa suministrada al puerto lateral del soporte de pipeta usado. Esto se puede hacer usando una jeringa, a través de una boquilla o un regulador de presión controlado electrónicamente. En este protocolo, se aplica presión positiva y negativa a través de una boquilla.
- Acérquese lentamente a la célula con la pipeta de parche desde la parte superior y alivie la presión positiva justo antes de tocarla.
NOTA: Cuando la punta está cerca de la celda, la resistencia aumentará ligeramente; Esto se indica mediante un tamaño reducido del pulso de prueba.
- Cambie la "prueba de membrana" de "modo de baño" a "modo de parche", por lo tanto, el potencial de retención al potencial de reposo esperado de las celdas (-30 a -40 mV).
- En algunos casos, la configuración conectada a la celda se forma después de la liberación de la presión positiva. De lo contrario, aplique suavemente presión negativa para ayudar a la formación de gigaseal.
nota: La configuración conectada a la célula se establece cuando el pulso de prueba se reduce a dos pequeños picos capacitivos al principio y al final del pulso y la resistencia de la membrana está en el rango GΩ; Los voltajes negativos de hasta -60 mV podrían facilitar la formación de gigaseal.
- Compense la capacitancia de la pipeta girando las perillas de "compensación de capacitancia de pipeta" para obtener una respuesta plana del pulso de prueba.
- Rompa el parche sin destruir el sello mediante la aplicación de pulsos cortos de presión negativa o presión negativa con fuerza creciente, para obtener la conformación de la célula completa.
nota: La transición exitosa de la configuración conectada a la celda completa se indica mediante un aumento de los picos capacitivos.
- Aplique la compensación de resistencia en serie mediante la configuración de los parámetros de celda completa y los ajustes de compensación del amplificador utilizado para una sujeción precisa del potencial de membrana al voltaje de retención deseado.
- Cambie la "prueba de membrana" al modo "celda completa", en el panel "Compensación de resistencia en serie" active la "predicción" y la "corrección" hasta en un 90% evitando sobreimpulsos y oscilaciones de la respuesta capacitiva, encienda el interruptor de compensación de celda completa y ajuste los parámetros de la celda completa con las perillas adecuadas del panel frontal ("capacidad de celda completa" y "resistencia en serie") del amplificador de manera iterativa para obtener una Respuesta de sello de prueba plana.
nota: Para obtener una descripción detallada de la compensación y corrección de la resistencia en serie, consulte el manual o la guía del amplificador, ya que este procedimiento varía entre los diferentes fabricantes.
- Después de establecer la configuración de la célula completa, espere al menos 2 minutos antes de registrar para garantizar un reemplazo suficiente de la solución intracelular a través de la pipeta de parche.
- Registre las corrientes inducidas por la luz a diferentes potenciales de retención utilizando los protocolos que se establecieron anteriormente (en 1.2).
- Cambie el tampón extracelular a [Cl-] bajo en la cámara al menos cinco veces sin destruir el parche y registre otra relación corriente-voltaje (cf. paso 1.2) a la nueva concentración de cloruro.
nota: Un sistema de perfusión para el intercambio automatizado de tampones facilita este proceso, pero no es necesario.
- Repita 2.15. para cada condición iónica que se vaya a probar, pero verifique repetidamente la calidad del parche entre las mediciones mediante una "prueba de membrana" descrita anteriormente><.
nota: Para garantizar un voltaje de membrana preciso y una composición iónica intracelular estable, la resistencia de la membrana debe estar por encima de 500 MΩ, mientras que la resistencia de acceso no debe superar los 10 MΩ (véase 2.12.6). No olvide desactivar la compensación de parámetros de toda la célula para la prueba de membrana.
- Repita de 2.2 a 2.15. para varias celdas, pero tome una nueva hoja de cubierta para cada serie de pruebas para garantizar la salud de las células.
Tabla 1: Composición iónica de las soluciones tamponadas. Composición de tampones intracelulares (intra.) y extracelulares (extra.) para experimentos de selectividad de cloruro en células HEK. Abreviaturas utilizadas: ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES) y aspartato (ASP). Todas las concentraciones están en mM.
| intra. | extra.1 | extra.2 |
| alto contenido de cloruro | bajo contenido de cloruro | bajo contenido de cloruro |
| c [mM] | c [mM] | c [mM] |
| Na-ASP | 0 | 0 | 140 |
| NaCl | 110 | 140 | 0 |
| Kcl | 1 | 1 | 1 |
| CsCl | 1 | 1 | 1 |
| CaCl2 | número arábigo | número arábigo | número arábigo |
| MgCl2 | número arábigo | número arábigo | número arábigo |
| HEPES | 10 | 10 | 10 |
| EGTA | 10 | 0 | 0 |
| pH | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| osmolaridad | 290 mOsm | 320 mOsm | 320 mOsm |
