Grabaciones de patch-clamp perforado de cuerpos de células de neuronas sensoriales del oído interno

Resumen

Fuente: Iyer, M. R., et al. Aislar y cultivar somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp. J. Vis. Exp. (2023).

Este video muestra la técnica de patch-clamp para medir las corrientes iónicas en los cuerpos de las células de las neuronas sensoriales del oído interno. En él se detalla la preparación y el uso de una pipeta de pinza parche pulida rellena con una solución interna que contiene anfotericina B, que perfora la membrana para permitir el movimiento de los iones mientras se conservan las condiciones intracelulares. Los pulsos de voltaje se aplican para activar y registrar la actividad del canal iónico, lo que proporciona información sobre sus propiedades y comportamiento.

Protocolo

1. Grabación

NOTA: En este procedimiento, las grabaciones de patch-clamp del ganglio aislado se realizan típicamente 12-24 h después de la colocación de la placa. Otros laboratorios han reportado resultados de neuronas después de períodos mucho más largos en cultivo.

1. Preparación de la cámara de grabación
   1. Utilice la cámara de grabación de intercambio rápido (o equivalente) que permite realizar grabaciones con pinza de parche directamente en la placa de cultivo. Configure la cámara en el microscopio invertido.
   2. Inserte las placas de cultivo con fondo de vidrio en la cámara.
   3. Alimente la solución L-15 a través de un sistema de tubos de perfusión a la cámara de registro. Estabilice el flujo de entrada y salida de perfusión en la cámara a una tasa de 0,5-1 mL por minuto.
2. Preparar la solución interna para cargar los electrodos
   1. Descongele una alícuota de la solución interna del parche perforado. Asigne 2,5 mL de la solución en una placa de cultivo de 35 mm. Vuelva a colocar la tapa de la placa de cultivo y etiquétela como "Tip Dip". Reservar en una zona libre de polvo, ya que es muy importante mantener esta solución lo más limpia posible.
   2. Pesar 1 mg de anfotericina-B y añadir 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Haga un vórtice y centrifuga la solución hasta que toda la anfotericina-B esté en la solución. Añadir 10 μL de la solución de DMSO/anfotericina-B a los 2 mL restantes de la solución interna de parche perforado descongelada. Retire y disipe la solución con una pipeta dos o tres veces para asegurarse de que el DMSO/anfotericina-B se ha mezclado uniformemente con la solución interna. La solución tendrá un tinte amarillento suave.
   3. Extraiga la solución interna del parche perforado de anfotericina-B en una jeringa de 3 ml. Añada una punta de 34 g a la jeringa. Envuelva la jeringa en papel de aluminio y manténgala en hielo.
      nota: Esta solución debe rehacerse cada 2 h para garantizar la eficacia de la anfotericina-B en la perforación de la membrana celular. La anfotericina-B es sensible a la luz y debe protegerse de la luz con papel de aluminio u otros métodos.
3. Grabaciones de patch-clamp
   1. Visualiza las neuronas usando un objetivo de 10x o 20x. Ajuste la iluminación y optimice la óptica para ver los límites y las sombras alrededor de la celda.
   2. Comprobar la calidad de las neuronas aisladas. Pruebe solo con neuronas con superficies lisas y uniformes que no estén demasiado contrastadas y que solo tengan cráteres pequeños y dispersos. Además, asegúrese de evitar pares de neuronas, neuronas rodeadas de desechos u otras células.
   3. Con un aumento de 100x, identifique una neurona o un campo de neuronas para parchear y alinéelas en el centro del campo de visión.
   4. Llene la punta de la pipeta con una solución limpia que no contenga anfotericina sumergiendo la punta (durante ~20 s) en la solución limpia que se colocó en una placa de cultivo. La acción capilar arrastrará una pequeña cantidad de solución hacia la punta.
      nota: Realice este paso bajo un microscopio de disección estereoscópica, que permite determinar qué tan bien la punta sostiene la solución de inmersión de punta. Si la solución no se mantiene durante ~10-20 s, la forma del electrodo no es la ideal. En este caso, vuelva a configurar el programa de extracción de electrodos para producir una punta más larga.
   5. A continuación, llene la parte posterior de la pipeta con la solución interna que contiene anfotericina. El filamento dentro de la pipeta extraerá la solución para encontrarse con la solución limpia en la punta. Deja que el filamento tire suavemente de la solución hacia abajo y no intentes sacar las burbujas, ya que esto hará que la anfotericina llegue a la punta demasiado rápido.
   6. Use una jeringa para extraer la solución que pueda estar en la parte posterior del electrodo.
      nota: Es muy importante trabajar rápido desde este punto hasta aterrizar y formar un sello de alta resistencia en la celda deseada.
   7. Inserte la pipeta en el soporte de la pipeta. Compruebe que la pipeta esté ajustada en el soporte para evitar que la pipeta se desvíe. Si la pipeta no es estable, cambie las juntas tóricas de sellado en la parte delantera y trasera del soporte de pipeta para minimizar la deriva y mantener una succión fuerte. Sustituya la pipeta por una que esté recién llena.
   8. Baje la pipeta en el baño de la cámara de grabación.
   9. Coloque la punta de la pipeta en el centro del campo de visión. Asegúrese de que la punta esté libre de burbujas de aire u otros residuos.
   10. Aplique un paso de voltaje (5 mV) en la prueba de membrana para monitorear la resistencia de la pipeta. Continúe monitoreando la resistencia de entrada durante todo el proceso de formación de un sello en la celda.
   11. Cancele el potencial de compensación de la pipeta, de modo que la corriente de la pipeta sea cero en el modo de prueba de membrana de pClamp.
   12. Corrija la capacitancia de la pipeta utilizando la función de compensación rápida de capacitancia en el amplificador de abrazadera de parche (diales rápidos Cp en el panel de software Multiclamp Commander).
   13. Mueva la pipeta hacia abajo hasta la celda.
   14. Una vez que la pipeta esté lo suficientemente cerca de la neurona, cambie al objetivo de mayor aumento y envíe la imagen a través de una cámara a un monitor (use un objetivo de 40x, aumento total de 400x). Ajuste la pipeta y vuelva a centrar la neurona.
   15. Acerque el electrodo de registro al soma. Ubique el centro de la neurona en el monitor y coloque el electrodo de registro sobre la neurona.
   16. Acércate a la neurona desde arriba, de modo que el electrodo aterrice en el centro de la celda esférica. Ajuste el desplazamiento de la pipeta a cero los potenciales de CC constantes en el sistema.
   17. Coloque la pipeta cerca de la membrana. Aterriza firmemente en el centro de la celda.
       nota: Al aterrizar, se producirá un pequeño hoyuelo en la superficie de la neurona y una duplicación/triplicación de la resistencia de entrada.
   18. Aplique presión negativa (succión) con una jeringa o pipeta bucal. Encienda el potencial de retención de -60 mV. La resistencia del sello debe aumentar hasta que pase un giga-ohm.
       nota: Trabaje rápido para reducir el tiempo entre el llenado de un electrodo y el aterrizaje en una celda. Hay un tiempo limitado antes de que la anfotericina añadida a la solución interna del parche perforado llegue a la punta del electrodo. Una vez que la punta está contaminada con anfotericina, es difícil formar sellos de alta resistencia, y la resistencia a menudo se estabiliza a ~ 200 megaohmios.
   19. Una vez que se forme un sello de giga-ohmios, libere la presión negativa. Tan pronto como se forme el sello, aplique una compensación de capacitancia rápida para reducir la amplitud de los transitorios de capacitancia de la pipeta en el modo de prueba de membrana tanto como sea posible.
   20. A medida que la anfotericina comienza a funcionar, observe cómo la resistencia de entrada disminuye lentamente y la corriente que fluye en respuesta al paso de voltaje de 5 mV aumenta progresivamente a medida que la anfotericina ingresa a la membrana. Una disminución repentina de la resistencia en serie en lugar de una estabilización gradual sugiere que se ha producido una ruptura espontánea.
   21. Estime la capacitancia de toda la celda y la resistencia en serie utilizando la función de anulación transitoria capacitiva del amplificador. Documente y controle la resistencia en serie al comienzo del experimento y regularmente durante él.
       nota: La resistencia en serie puede tardar entre 5 y 20 minutos en estabilizarse, dependiendo del tamaño del electrodo y de la cantidad de solución limpia que se introduzca en la pipeta. Los modos de pinza de voltaje y pinza de corriente se pueden usar una vez que la resistencia en serie se haya estabilizado por debajo de 30 megaohmios. A veces se observa hinchazón o encogimiento de las neuronas durante el registro, pero raramente cuando la osmolaridad y el pH de las soluciones se ajustan correctamente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
anfotericina	Sigma-Aldrich	A4888-100MG	Para grabaciones de parches perforados.
ATP disódico	Sigma-Aldrich	A7699	Aditivo a la solución interna
CaCl2	J.T. Baker	1311-01	Aditivo a la solución interna
Dmso	Biotio	90082
EGTA	Sigma-Aldrich	E0396	Aditivo a la solución interna
Extractor de electrodos	Narashige	PC-10
etanol	Laboratorios de descontaminación	Año 2716	para la limpieza del cabezal y alrededor del banco de disección
Capilares de borosilicato filamentado para electrodos	Instrumentos Sutter	BF140-117-10
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	para tampón de pH de todas las soluciones del protocolo
Placa calefactora / agitadores magnéticos	VWR	76549-914
K2SO4, sulfato de potasio	Sigma Aldrich	P9458-250G	Aditivo a la solución interna
Kcl	Sigma-Aldrich	P93333	Aditivo a la solución interna
KOH (1 M)	Honeywell	319376-500ML	Para llevar la solución interna al pH deseado.
Cámara de grabación de baño de bajo perfil para placas de cultivo	Instrumentos Warner	64-0236
MgCl 2-Hexahidrato	Sigma-Aldrich	M1028	Aditivo a la solución interna
Aguja microFil para el llenado de micropipetas - calibre 34	Instrumentos de precisión mundial	MF34G
Microforja	Narashige	MF-90	Para el pulido de electrodos.
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Aditivo a la solución interna
NaOH (1 M)	Thomas Científico	319511-500ML	para la valoración del pH
Oxígeno, grado médico, con regulador y tubo adecuados	Gestión de materiales de la USC	MEDOX200 (Identificador: 00015)	para disolver en soluciones de disección y baño
Fondo de vidrio recubierto de poli-d-lisina Plato de cultivo	Mattek	P35GC-0-10-C	para placas de neuronas para cultivo
Filtros de membrana PES, 0,2 micrómetros	Nalgene	566-0020	para soluciones de filtrado
Filtros de jeringa estériles con membrana PES, 0,22 mmm, 30 mm	CELLTREAT	229747	para filtrar soluciones introducidas en jeringas
Medidor de pH	Mettler Toledo	Modelo S20
Celda de referencia	Instrumentos de precisión mundial	RC1T
Escala Científica	Mettler Toledo	XS64
Matraz aforado, 1000 mililitros
Agua, estéril, R>18.18 megaOhms cm (por ejemplo, filtrada por un sistema de purificación de agua Millipore-Sigma)	Millipore-Sigma	CDUFBI001