Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de electrodos (Figura 1A-C)
NOTA: Los loci de los pines de la computadora son simplemente un contacto con punta como parte de la interfaz de señal en los dispositivos de comunicación. Consiste en un conector macho que se conecta al conector hembra.
- Separe cuidadosamente los pines macho y hembra de los lugares de los pines de la computadora (Figura 1A) con la ayuda de una pinza. Conecte los pines macho y hembra para formar un electrodo y aplique cianoacrilato para crear una fuerte unión adhesiva (Figura 1C).
- Coloque los electrodos en un vaso de precipitados lleno de agua destilada y colóquelo en un limpiador ultrasónico durante 10 min. Déjelos pasar a un horno de secado a 45 °C durante 30 min. Esterilice los electrodos con luz ultravioleta (UV) durante 30 min.
>2. Procedimiento quirúrgico (Figura 1D-F)
- Preparar el instrumental quirúrgico esterilizado y el aparato estereotáxico. Anestesiar a la cría de rata neonata con anestesia isoflurano (2,5 %) con aire. Cuando el cachorro esté profundamente anestesiado, ajuste la dosis de isoflurano al 1,0%. Realice un pellizco en la cola o en los dedos de los pies antes de la cirugía para garantizar la profundidad adecuada de la anestesia.
- Fije la cabeza del cachorro en el aparato estereotáxico colocando las barras de la oreja en los canales auditivos y apretándolas ligeramente.
nota: No apriete excesivamente las barras de las orejas, ya que el cráneo neonatal es muy blando.
- Mantener el campo quirúrgico estéril rociando todo el equipo con etanol al 70%. Haz una incisión de 15 mm en la cabeza con un bisturí. Con fórceps, aleje suavemente el cuero cabelludo de la línea media en las cuatro esquinas. Coloque un poco de algodón empapado en solución salina debajo de la piel para mantener la incisión completamente abierta (Figura 1D).
- Encuentra los puntos bregma y lambda en el cráneo y márcalos con un lápiz. Utilice una aguja de jeringa (26 G) para hacer dos agujeros en la corteza prefrontal (PFC) y el hipocampo.
nota: El PFC se localiza a +1,8 mm posterior al bregma y a -0,5 mm lateral a la línea media, mientras que el hipocampo se localiza a -2,0 mm anterior al bregma y a ±0,5 mm lateral a la línea media (Figura 1D y E). La profundidad del electrodo no debe estar a más de 2 mm por debajo de la superficie cortical para minimizar el daño cerebral.
- Utilice pinzas para sujetar los electrodos e inserte los electrodos de referencia y de registro en el PFC y el hipocampo, respectivamente. Aplique la pomada de eritromicina alrededor del electrodo para evitar cualquier posible infección. Fije el electrodo con cianocrilato.
- Prepara el cemento acrílico dental para que tenga una consistencia pegajosa y viscosa. Aplique el cemento dental para cubrir los electrodos y el resto del cráneo.
nota: Seque bien el cráneo antes de aplicar el cemento dental.
- Aplique ácido pícrico al 5% sobre los electrodos para protegerlos.
nota: Todo el procedimiento debe realizarse en una campana de bioseguridad para mantener las condiciones estériles.
- Retirar al animal del marco estereotáxico e inyectar 300 μL de glucosa al 10% por vía subcutánea. Colóquelo sobre una manta térmica para su recuperación. Asegúrese de que el animal esté caliente (37 °C) y deambulatorio (es decir, completamente recuperado). Administrar buprenorfina por vía intraperitoneal (0,05 mg/kg) para el dolor postquirúrgico
nota: No deje a un animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente (es decir, el comportamiento y el movimiento normales).
- Regrese al cachorro a su jaula de origen con su madre después de que recupere la conciencia. Espere dos días hasta que el animal esté completamente recuperado.
3. Registro de EEG
- Después de la recuperación completa, conecte los electrodos implantados en el cráneo del cachorro al amplificador en su propia jaula. Conecte el amplificador a un convertidor de analógico a digital y conecte el convertidor a una computadora; Las líneas de conexión deben tratarse con cuidado para que no se enreden.
- Seleccione una frecuencia de muestreo de al menos 10.000 Hz en la unidad de adquisición de datos para la grabación (el ancho de banda del transmisor es de 1-100 Hz). Asegúrese de que los datos se muestrean correctamente.
- Después de obtener el registro basal, inyecte al cachorro por vía intraperitoneal ácido kaínico (KA, 2 mg/kg) para inducir convulsiones epilépticas. 15 minutos después de la inyección de KA observe y registre las secreciones epilépticas. Las convulsiones producidas a través de KA suelen ser físicas
NOTA: La duración del tónico ictal es de aproximadamente 15,2 ±0,9 s, la duración de las convulsiones es de aproximadamente 62±5 s. Las convulsiones pueden prevenirse en la rata neonata mediante la inyección IP de hidrato de cloral (400 mg/kg).
- Guarde los datos digitalizados y analícelos utilizando paquetes de software de procesamiento de señales, como spike2. Revele el nivel de potencia de los diferentes componentes de frecuencia en la señal de EEG neonatal mediante la realización de un análisis del espectro de potencia. Calcule la potencia en un período de tiempo de 1 minuto encontrando la amplitud cuadrática media de 1 a 100 Hz (banda EEG).
