Registro de las conexiones neuronales en cortes cerebrales agudos

Resumen

Fuente: Qi, G., et al. Caracterización electrofisiológica y morfológica de microcircuitos neuronales en cortes agudos de cerebro utilizando registros pareados de patch-clamp. J. Vis. Exp. (2015)

Este video muestra el procedimiento para mapear las conexiones sinápticas asegurando un corte de cerebro, colocando pipetas para lograr configuraciones de células completas y estimulando las neuronas presinápticas para registrar respuestas postsinápticas, dilucidando así la conectividad neuronal.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

>1. Registro emparejado de patch-clamp y llenado de biocytin

Dependiendo del tipo de conexión sináptica, se utilizan tres enfoques diferentes para encontrar neuronas acopladas sinápticamente. Si la probabilidad de conexión es baja (como se puede esperar para la mayoría de las conexiones excitatorias), proceda de la siguiente manera:

1. Conexiones neuronales con baja conectividad
   1. Llene las pipetas de parche con una solución interna de la composición indicada en la Tabla 1. Para todos los registros en la configuración de célula entera, agregue biocitina a concentraciones entre 3 y 5 mg/ml a la solución interna (pipeta) para obtener buenos resultados de tinción para las neuronas pre y postsinápticas. Deje que la biocitina se difunda en la célula durante al menos 15 a 30 minutos (dependiendo del tamaño de la neurona).
      NOTA: No añada biocitina a la solución utilizada en las pipetas de "búsqueda" que se mencionan a continuación.
   2. Parchear una neurona postsináptica putativa en el modo de célula completa. Utilice pipetas de parche con un vástago largo y delgado. Esto facilita la maniobrabilidad de la pipeta bajo el objetivo y reduce los artefactos de movimiento que pueden producirse cuando se introduce el electrodo en el corte.
   3. A continuación, se coloca un parche en una posible neurona presináptica en una configuración adherida a una célula utilizando una pipeta de parche de "búsqueda" de 8 a 10 MΩ de resistencia y un diámetro de punta pequeño. Estas pipetas establecen un parche "suelto" adherido a la célula. Llene la pipeta de "búsqueda" con una solución interna en la que K⁺ sea reemplazado por Na⁺ (Tabla 2) para evitar que las neuronas se despolarizen durante la búsqueda >NOTA: La resistencia del sello "suelto" no está en el rango GΩ, sino típicamente alrededor de 30 a 300 MΩ.
   4. Mantenga el potencial de membrana debajo del sello "suelto" a aproximadamente -30 a -60 mV en el modo de pinza de corriente. A continuación, aplique grandes pulsos de corriente (0,2 - 2 nA) para provocar un potencial de acción en la célula presináptica potencial. Observe este potencial de acción como una pequeña espiguilla en la respuesta de voltaje.
   5. Ajuste la frecuencia de estimulación a 0,1 Hz para evitar una disminución de una respuesta postsináptica. Utilice frecuencias de estimulación más bajas si el tejido cerebral es muy inmaduro o la conexión sináptica no es muy fiable.
   6. En caso de que la neurona 'postsináptica' no responda a la estimulación de la neurona 'presináptica' probada, coloque un parche en una nueva neurona en modo de sello 'suelto'. No sustituya el electrodo de parche de "búsqueda" mientras se establezca el sello con una resistencia de >30 MΩ. De esta manera, pruebe hasta 30 neuronas potencialmente presinápticas.
      nota: Para evitar dañar la neurona durante el procedimiento de búsqueda con una pinza de parche suelta, solo se debe aplicar una succión suave a la pipeta de búsqueda en comparación con la aplicada a la pipeta de parche de célula completa.
   7. Si la estimulación en el modo de sellado "suelto" da como resultado un EPSP/IPSP (potencial postsináptico excitatorio/potencial postsináptico inhibitorio) con una latencia <5 mseg en la neurona postsináptica, retire la pipeta de "búsqueda" de la neurona presináptica.
   8. Sustituya la pipeta de parche de "búsqueda" por un electrodo de parche lleno de solución interna regular que contenga biocitina. Asegúrese de que esta pipeta de parche de grabación tenga una resistencia de 4 a 8 MΩ; Cuanto mayor sea el tamaño del soma, menor puede ser la resistencia del electrodo.
   9. Conecte la neurona presináptica y registre en modo de pinza de corriente de célula completa. Provocar potenciales de acción por inyección de corriente en las neuronas presinápticas y registrar la respuesta postsináptica. Almacene los datos en una computadora para su posterior análisis fuera de línea.

Tabla 1. Solución de pipeta con bajo contenido de cloruro.

	milímetro	g/L	g/50 ml
K-gluconato	135	31.622	1.5811
Kcl	4	0,298	0.0149
HEPES	10	2.384	0.1192
fosfocreatina	10	2.552	0.1276
ATP-Mg2+	4	2.028	0.1014
GTP-NA	0.3	0.156	0.0078
Ajusta el pH a 7.3 con KOH
Osmolaridad ~300 mOsmol/L
Añadir 3 - 5 mg/ml de biocitina

Tabla 2. Solución de pipeta de alto Na para la búsqueda de neuronas acopladas sinápticamente.

	milímetro	g/L	g/50 ml
Na-gluconato	Artículo 105	22.92	1.146
NaCl	30	1.76	0,088
HEPES	10	2.384	0.1192
fosfocreatina	10	2.552	0.1276
ATP-Mg2+	4	2.028	0.1014
GTP-NA	0.3	0.156	0.0078
Ajusta el pH a 7.3 con NaOH
Osmolaridad ~300 mOsmol/L

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
amplificador	HEKA	EPC 10 USB Triple	con 2-3 preamplificadores
microscopio	Olimpo	BX51WI	con 2 puertos de cámara y un objetivo de 4×, un objetivo de inmersión en agua de 40×
cámara	Fotónica TILL	VX55	Cámara CCD infrarroja
estación de trabajo	Luigs & Neumann	Infraparche 240	con una platina X-Y motorizada y un eje de enfoque motorizado para el microscopio
Micromanipulador	Luigs & Neumann	SM-5	Manipuladores X-Y-Z para 2-3 preamplificadores
Jaula de Faraday	Luigs & Neumann
Mesa antivibratoria	Espectros de Newport-Física
Maestro de parches	HEKA
microtomo	Microm Internacional	HM650V
Extractor de micropipetas	HEKA	Sutter P-97
Sistema neurolúcido	Microcampo brillante		con los softwares Neurolucida y Neuroexplorer