Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.
1. Grabaciones de Patch Clamp
- Coloque la solución de electrodo (ver Tabla 1) sobre hielo para evitar la degradación. Llene la pipeta de parche de vidrio con solución intracelular filtrada (filtro de jeringa, tamaño de poro: 0,2 μm) y coloque la pipeta en el soporte de pipetas de la etapa principal. Aplique una presión suave y positiva a la pipeta a través de una jeringa de 5 ml desplazando el émbolo aproximadamente 1 ml antes >Nota: Esto evita que la pipeta se bloquee.
- Elija el modo "V-clamp" girando la perilla de modo en el amplificador, luego abra la interfaz "Prueba de membrana" en el software. Acerque la pipeta a la neurona objetivo bajo inspección microscópica.
nota: En la preparación intacta de DRG, una fina capa de células gliales satélite encapsula cada neurona.
- Utilice la presión positiva de la pipeta para atravesar la capa de células gliales satélite hasta que se observe un aumento repentino del espacio entre la neurona y la capa circundante de células gliales satélite. Siga moviendo la pipeta hacia la neurona hasta que se observe un "hoyuelo" en la neurona.
nota: En comparación con las grabaciones de neuronas disociadas, la presión positiva debe ser ligeramente mayor, lo que ayudará a penetrar en la capa de células gliales satélite y aumentará las posibilidades de éxito del parcheo.
- Reduzca la presión positiva. A continuación, logre un sello de giga ohmios con una succión suave.
nota: Con este método, la tasa de éxito de la grabación es de al menos el 70%.
- Obtenga la configuración de grabación de celda completa como se describió anteriormente.
- Penetra brevemente en la membrana de la célula neuronal a través de una succión corta pero fuerte. Alternativamente, use la función "zap" del amplificador mientras se aplica la succión.
- Una vez que se establece un modo de celda completa, compense la capacitancia de la celda completa y la resistencia en serie (Rs) girando las perillas de compensación de capacitancia y resistencia en el amplificador><.
nota: Rs es normalmente de 5-20 MΩ.
- Abandone la celda si Rs es inicialmente superior a 30 MΩ o cambia en más de un 20% durante la grabación. Además, mida el potencial de membrana en reposo; abandone una celda si es superior a -50 mV.
- Cierre la ventana "Prueba de membrana". Elija el modo "I-clamp normal" girando la perilla de modo en el amplificador.
- Haga clic en "abrir protocolo" en el software, seleccione y cargue el protocolo para medir la reobase. Haga clic en "grabar" para comenzar a grabar. Mida la resistencia de entrada y la reobase para examinar la excitabilidad neuronal inyectando una serie graduada de corrientes despolarizantes en pasos de 100 pA.
- Haga clic en "abrir protocolo" en el software, seleccione y cargue el protocolo para medir la reobase. Haga clic en "grabar" para comenzar a grabar. Mida la resistencia de entrada y la reobase para examinar la excitabilidad neuronal inyectando una serie graduada de corrientes despolarizantes en pasos de 100 pA.
- Utilice un software de adquisición y análisis de datos (por ejemplo, Clampfit) para analizar las trazas registradas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El software calcula la resistencia de entrada (Rin) en función de la relación I-V en estado estacionario durante las corrientes hiperpolarizantes suministradas. Mueva el cursor para medir el valor de la reobase y el umbral de membrana. nota: La amplitud de corriente requerida para inducir el PA se define como la reobase, y el voltaje más bajo para inducir el PA se define como el umbral de membrana.
- Registre las corrientes inducidas por el ligando.
- Llene una pipeta con los agonistas específicos.
Nota: En el presente informe, utilizamos 100 μM de glutamato y 100 μM de AITC para inducir las corrientes mediadas por los receptores de glutamato y los receptores TRPA1 respectivamente.
- Compruebe la pipeta para asegurarse de que no hay burbujas de aire en su interior. Coloque la pipeta en el soporte para pipetas. Conecte el soporte de pipetas con un tubo conectado a un sistema de dispensación de medicamentos.
- Utilice el manipulador para mover la pipeta a menos de 50 μm de la neurona. Ajuste la presión del sistema de dispensación de medicamentos a 1 psi y la duración a 1 seg. Cambie el modo de grabación a pinza de voltaje y pinza a -70 mV. Aplique brevemente la presión a través del sistema de dispensación de medicamentos para registrar una corriente inducida por medicamentos.
Tabla 1
| 100 ml de solución intracelular |
| Concentración (mM) | componente | Mw | g |
| 130 | KGluconato | 234.24 | |
| 10 | Kcl | 74.55 | |
| 10 | HEPES | Artículo 238.3 | |
| 10 | EGTA | | |
| número arábigo | MgCl2 * 6H2O | Artículo 203.3 | |
| Notas: Ajuste el pH a 7.4 con KOH y la osmolaridad a 260 - 280 mOsm con sacarosa y agua destilada. Añadir 2 mM de MgATP, 0,5 mM de Na, 2GTP y filtrar antes de su uso inmediato. |
