Evaluación de sinapsis en cinta en regiones de frecuencia específicas de la cóclea de ratón

Resumen

Fuente: Yu, S., et al. Evaluación morfológica y funcional de sinapsis en cinta en regiones de frecuencia específicas de la cóclea del ratón. J. Vis. Exp. (2019).

Este video muestra un método para evaluar las sinapsis de cinta en regiones específicas de la cóclea del ratón. Utiliza técnicas de inmunotinción e imágenes confocales para identificar sinapsis funcionales en diferentes regiones de frecuencia en cada turno coclear.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con el manejo de animales se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Selección de animales

1. Para todos los experimentos, utilice ratones machos C57BL/6J adultos (8 semanas de edad) como modelo animal.
   NOTA: Los ratones C57BL/6J portadores de una variante de empalme del Cdh23 presentan una senescencia acelerada en el sistema auditivo, que se refleja en una pérdida del 40% de las sinapsis en cinta en el giro basal de la cóclea y una pérdida del 10% en el giro medio a los 6 meses de edad, seguido de un rápido aumento de esta pérdida en toda la cóclea con la edad. Por lo tanto, aconsejamos precaución al utilizar ratones C57BL/6J mayores de 6 meses para la investigación auditiva. Se pueden utilizar otras cepas de ratones en función de objetivos experimentales específicos.
2. Inspeccione los ratones con un otoscopio de bolsillo de diagnóstico profesional para descartar patologías del oído externo o medio antes de las evaluaciones auditivas. Los signos potenciales pueden incluir líquido o pus en el conducto auditivo externo, enrojecimiento e hinchazón en el tejido local y perforación de la membrana timpánica.
   NOTA: Aunque esto rara vez se encuentra, una vez identificados, se deben excluir los ratones con enfermedades del oído externo o medio.

>2. Evaluación de la audición

1. Anestesiar ratones mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina (100 mg/kg) y clorhidrato de xilacina (10 mg/kg). Juzgar la profundidad de la anestesia a través de estímulos dolorosos (p. ej., reflejo de pellizco de los dedos de los pies).
   NOTA: Cuando el reflejo de pellizco de los dedos del pie está completamente ausente, el animal ha alcanzado una profundidad adecuada de anestesia para las pruebas auditivas. Si se requiere más tiempo para los registros bilaterales de ABR (respuesta auditiva del tronco encefálico), administre una dosis más baja (una quinta parte de la dosis original) de anestésicos para restaurar el plano anestésico original. Tenga cuidado de evitar una sobredosis de anestésicos, ya que esto puede provocar la muerte en ratones.
2. Mantener la temperatura corporal del animal anestesiado a 37,5 °C utilizando una almohadilla térmica termorreguladora. Coloque al animal anestesiado en una habitación blindada eléctrica y acústicamente para evitar interferencias durante toda la prueba >NOTA: Mantener la temperatura fisiológica durante todo el procedimiento hasta que el animal esté totalmente despierto para evitar la muerte causada por hipotermia postanestésica.
3. Colocar electrodos de aguja subdérmicos (20 mm, 28 G) en el vértice del cráneo (electrodo de registro), en la región de la parótida ipsilateral por debajo del pabellón auricular medido (electrodo de referencia) y en la región de la parótida contralateral (electrodo de tierra), con una profundidad de 3 mm por debajo de la piel de la cabeza del ratón, respectivamente.
4. Utilice un altavoz de campo cerrado para realizar la estimulación acústica a través de un tubo de plástico de 2 cm con una punta en forma de cono. Coloque la punta en el canal auditivo externo.
   NOTA: Asegúrese de que la impedancia eléctrica en los electrodos de registro y referencia sea inferior a 3 kOhm (generalmente 1 kOhm). Si la impedancia es alta, cambie el sitio de inserción del electrodo, limpie el electrodo con alcohol o reemplace el electrodo para evitar alteraciones en la amplitud de onda ABR.
5. Para la grabación ABR, genere pips de tono (3 ms de duración, tiempos de subida/bajada de 1 ms, a una velocidad de 21,1/s, frecuencia: 4–48 kHz) y preséntelos a niveles de presión sonora (SPL) decrecientes de 90 a 10 dB en pasos de 5-10 dB SPL. Durante este paso, las respuestas se amplifican (10.000 veces), se filtran (0,1-3 kHz) y se promedian (1.024 muestras/nivel de estímulo)
   NOTA: Los ABR se recogen para cada nivel de estímulo en pasos de 10 dB, con pasos adicionales de 5 dB cerca del umbral.
6. En cada frecuencia, determine el umbral ABR, que se refiere al SPL mínimo que da como resultado una grabación ABR confiable con una o más ondas distinguibles que se pueden identificar claramente mediante inspección visual><. NOTA: Por lo general, es necesario repetir el proceso para SPL bajos alrededor del umbral para garantizar la consistencia de las formas de onda. El umbral de respuesta es el nivel de estímulo más bajo en el que se puede observar la forma de onda cuando una disminución de 5 dB conduciría a la desaparición de la forma de onda.

>3. Procesamiento de tejido coclear

1. Después de la grabación de ABR, eutanasiar a los ratones anestesiados mediante dislocación cervical, decapitarlos, exponer la bulla desde el lado ventral y abrirlos con tijeras afiladas para acceder a la cóclea.
2. Con pinzas finas, extirpe los huesos temporales, corte la arteria del estribo, extraiga el estribo de la ventana oval y rompa la membrana redonda de la ventana. Haga un pequeño orificio en el ápice de la cóclea girando suavemente la punta de una aguja (13 mm, 27 G).
3. Fijar los huesos aislados con paraformaldehído al 4% (peso/vol) en solución salina tamponada con fosfato 0,1 M (PBS, pH 7,4) durante la noche a 4 °C. Con una pipeta de punta fina, enjuague suavemente el fijador a través de los espacios perilinfáticos mediante aplicación en las ventanas ovaladas o redondas (como entrada) y en la abertura en el ápice (como salida)
   NOTA: Algunas proteínas requieren una corta duración de fijación para evitar la destrucción de sus epítopos para el inmunomarcaje. En tales casos, incubar los huesos en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente (RT) durante 2 h, según las instrucciones del fabricante para la inmunohistoquímica. La fijación también se puede realizar a través de la perfusión cardíaca para eliminar la sangre coclear, evitando el ruido de fondo debido a la tinción inespecífica en etapas posteriores, particularmente en modelos de ratón de sinaptopatía coclear.
4. Enjuague los huesos tres veces durante 5 minutos con PBS frío 0,1 M para eliminar el paraformaldehído residual. Descalcificar los huesos con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 10% durante 4 h o a 4 °C durante 24 h mediante una agitación suave en un agitador horizontal a 20 rpm. EDTA se puede actualizar a mitad de camino.
   NOTA: Los tiempos de descalcificación están sujetos a la concentración de EDTA y a las preferencias de los usuarios. El tejido descalcificado debe mantener un cierto grado de tenacidad, lo que facilita la manipulación del aislamiento de las monturas enteras cocleares en pasos posteriores. Los huesos temporales se pueden descalcificar en EDTA al 10% con rotación, lo que permite a los investigadores abandonar el laboratorio después de las pruebas ABR y los experimentos de fijación. El tiempo de descalcificación es flexible dentro del rango de 20 a 30 h a 4 °C.
5. Transfiera un hueso temporal descalcificado de EDTA a 0,1 M PBS. Utilice las pinzas Dumont #3 y #5 y la aguja de 27 G para diseccionar las regiones cocleares apical, media y basal a su vez y luego diseccionar la cóclea del hueso bajo un microscopio de disección estereoscópica. Haga una serie de pequeños cortes a lo largo del ligamento espiral con una cuchilla de afeitar y retire la membrana tectorial y la membrana de Reissner (Figura 1).
   NOTA: Siempre que la cóclea disecada esté intacta, este proceso puede modificarse de acuerdo con el protocolo habitual de cada operador.
6. Diseccione aún más el epitelio auditivo restante, incluido el limbo espiral, en giros cocleares individuales (ápice, medio y base con región gancho) para preparaciones de montaje completo.
7. Bajo un objetivo de aceite de 40x de un microscopio óptico, mida la longitud de la membrana basilar con una escala de 250 μm colocada en el ocular, que se puede ajustar a lo largo de los estereocilios de las IHC.
8. Calcule la longitud de cada vuelta coclear sumando todas las longitudes de los segmentos (250 μm por segmento) y, concomitantemente, obtenga la longitud total de la membrana basilar sumando las longitudes de cada vuelta.
9. Convierta la longitud total de la membrana basilar, incluida la región del gancho, en un porcentaje basado en la distancia desde el ápice coclear (0% se refiere al ápice coclear, 100% a la base coclear).
10. Convierta esta distancia en la frecuencia característica de la cóclea utilizando una función logarítmica (d(%) = 1 - 156,5 + 82,5 × log(f), con una pendiente de 1,25 mm/octava de frecuencia, donde d es la distancia normalizada desde el ápice coclear en porcentaje, f es la frecuencia en kHz), como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, se puede adquirir un rango de frecuencia en un área correspondiente de la membrana basilar en cada giro coclear.

>4. Tinción de inmunofluorescencia

1. Después de la disección, coloque cada vuelta coclear en un tubo de centrífuga independiente de 2,5 ml e incube las vueltas cocleares en suero de cabra al 10 %/PBS/0,1 % Triton X-100 durante 1 h a RT en un rotador.
2. Retirar la solución de bloqueo/permeabilización anterior de cada tubo utilizando una punta de pipeta de 200 μL bajo un microscopio de disección e incubar las muestras con anticuerpos primarios diluidos en suero de cabra/PBS/Triton X-100 al 0,1% al 5% durante la noche a 4 °C en un rotador.
   NOTA: Para el inmunomarcaje de las cintas sinápticas cocleares, utilice el marcador presináptico de ratón anti-proteína de unión 2 IgG1 anti-carboxi-terminal de ratón (CtBP2, marcando el dominio B de la proteína de andamiaje RIBEYE, 1:400) y el marcador postsináptico ratón receptor anti-glutamato 2 IgG2a (GluR2, marcando una subunidad del ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico o receptor AMPA, 1:200).
3. Enjuague tres veces durante 5 min con PBS frío 0,1 M para eliminar los anticuerpos primarios residuales e incube las muestras con anticuerpos secundarios diluidos en suero de cabra al 5%/PBS/Triton X-100 al 0,1% en RT durante 2-33 h en oscuridad en un rotador.
   NOTA: Prepare mezclas adecuadas de anticuerpos secundarios utilizando Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) y Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), que son complementarias a los anticuerpos primarios utilizados en el paso 4.2. Para mejorar la eficiencia del marcaje de las cintas sinápticas, recomendamos seleccionar anticuerpos secundarios específicos. Algunos laboratorios amplían la incubación con anticuerpos secundarios para aumentar el inmunomarcaje de GluR2.
4. Enjuague tres veces durante 5 minutos con 0,1 M de PBS para eliminar los anticuerpos secundarios residuales y transfiera las muestras de los tubos de centrífuga de 2,5 mL a placas de 35 mm que contengan 0,1 M de PBS.
5. Coloque una gota de medio de montaje que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en el portaobjetos y transfiera las muestras del PBS al medio de montaje. Coloque un borde de un cubreobjetos en el portaobjetos y suéltelo para que caiga suavemente.
   NOTA: Para asegurarse de que las células ciliadas miren hacia arriba y de que no se plieguen ni retuerzan las muestras cocleares durante el procedimiento, monte las muestras cocleares bajo un microscopio de disección estereoscópica.
6. Coloque los portaobjetos en una caja de portaobjetos a 4 °C durante la noche para dejar que los portaobjetos se sequen y luego obtenga imágenes bajo un microscopio confocal láser.

>5. Evaluación morfológica de las sinapsis de cinta coclear

1. Diapositivas de imágenes utilizando un microscopio confocal con tres láseres: un diodo UV de 405 nm, un láser de argón de 488 nm y un láser de estado sólido bombeado por diodo (DPSS) de 561 nm para excitar DAPI (espectro de excitación 409-464 nm), Alexa Fluor 488 (espectro de excitación 496-549 nm) y Alexa Fluor 568 (espectro de excitación 573-631 nm), respectivamente.
2. Adquiera pilas z confocales a una distancia de 8 μm desde cada vuelta coclear utilizando una lente de inmersión en aceite de alta resolución de 63x.
   NOTA: Una vez definidos, todos los parámetros para digitalizar fotomicrografías deben guardarse y aplicarse uniformemente a todas las diapositivas.
3. Para los recuentos de puntos sinápticos, configure las pilas z (tamaño de paso de 0,3 μm) para que abarquen toda la longitud de las células ciliadas internas (IHC), asegurando así que se puedan obtener imágenes de todos los puntos sinápticos.
4. Combine las imágenes que contienen puntos en una pila z para obtener la proyección del eje z e impórtelas al software de procesamiento de imágenes.
5. Divida los recuentos totales sinápticos en cada pila z en regiones de frecuencia específicas por el número de IHC (igual a los recuentos manuales nucleares DAPI) para calcular el número de puntos sinápticos para cada IHC. En cada región de frecuencia específica, promedie todos los puntos sinápticos en tres imágenes de diferentes campos microscópicos que contienen 9-11 IHC.
   1. Describa la región de interés (ROI), incluidas las regiones basolaterales de cada IHC, utilizando el botón de selecciones a mano alzada. Utilice la función de medición para la cuantificación automática de puntos de puntuación y la función de cuenca hidrográfica para distinguir entre puntos muy adyacentes.
   2. Después de cada conteo automatizado, realice inspecciones visuales con correcciones manuales para garantizar que el conteo de puntos sea confiable.
      NOTA: Los experimentadores deben permanecer ciegos en cuanto a si el portaobjetos es desde el vértice, el medio o el giro basal de la cóclea.
6. Evalúe visualmente la estructura y distribución sináptica para aislar manualmente las IHC individuales de sus vecinas con la herramienta Lápiz (M) para visualizar mejor la arquitectura del citoesqueleto y la localización sináptica.
7. Para inspeccionar la yuxtaposición de cintas presinápticas (CtBP2) y parches de receptores postsinápticos (GluR2), extraiga el espacio vóxel alrededor de la cinta con la herramienta Marco rectangular y aísle la cinta individual por Recorte. Al hacer clic en Imagen > Tamaño de imagen, adquiera una matriz de miniaturas de estas proyecciones en miniatura, que luego se pueden usar para identificar sinapsis emparejadas (aparecieron como pares estrechamente yuxtapuestos de puntos CtBP2 positivos y GluR2 positivos) frente a cintas huérfanas (que carecen de parches de receptores de glutamato postsinápticos) (Figura 2)
   NOTA: Las sinapsis cocleares normales aparecen como inmunomarcaje combinado de la cinta presináptica dentro de la célula ciliada (anti-CtBP2) y el parche del receptor de glutamato postsináptico en la terminal del nervio auditivo (anti-GluR2). Algunos laboratorios utilizan proyecciones confocales junto con el modelado 3D para cuantificar el tamaño o el volumen de los parches sinápticos. Antes de la pérdida significativa de sinapsis de cintas, las cintas que muestran cambios de tamaño o sin parches de receptores de glutamato emparejados son probablemente indicativos de disfunción sináptica.

Resultados

Figura 1: Localización de la frecuencia coclear en ratones. (A) Una imagen representativa de la cóclea explantada completa, que se ha diseccionado del hueso temporal bajo un microscopio de disección estereoscópica. (B) La cóclea del ratón se divide en giros apical, medio y basal, donde se extirpa la pared lateral de la cóclea. Los círculos rojos en l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Clorhidrato de ketamina	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China	H35020148	100 mg/kg
Clorhidrato de xilacina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	X-1251	10 mg/kg
Aparato de fisiología TDT	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, EE. UU.	Sistema de Fisiología Auditiva III
Software SigGen/BioSig	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, EE. UU.	Sistema de Fisiología Auditiva III
Almohadilla eléctrica	Diversión para mascotas	11072931136
Pinzas Dumont 3#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canadá	0203-3-PO
Pinzas Dumont 5#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canadá	0209-5-PO
Microscopio estereoscópico de disección	Nikon Corp., Tokio, Japón	SMZ1270
Suero de cabra	ZSGB-BIO, Pekín, China	ZLI-9021
Receptor antiglutamato 2, extracelular, clon 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, EE. UU.	MAB397	ratón
Ratón purificado anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, EE. UU.	612044	ratón
Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón IgG1anticuerpo	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.	A21124	cabra
Alexa Fluor 488 anticuerpo IgG2a anti-ratón de cabra	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.	A21131	cabra
Medio de montaje que contiene DAPI	ZSGB-BIO, Pekín, China	ZLI-9557
Microscopía fluorescente confocal	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania	TCS SP8 II
Software Image Pro Plus	Cibernética de los Medios de Comunicación, Bethesda, MD, EE. UU.	Versión 6.0
Otoscopio de bolsillo de diagnóstico profesional	Lude Aparato Médico e Instrumentos Comercio Co., Ltd., Shanghai, China	HS-OT10
Electrodo de aguja	Amistad Electrónica Médica Co., Ltd., Xi'an, China	Artículo 1029	20 mm, 28 g
Altavoz de campo cerrado	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, EE. UU.	CF1