Evaluación de las interacciones entre las neuronas glutamatérgicas y las células de glioma en un cocultivo

Resumen

Fuente: Fuchs, Q. et. al., Cocultivo de neuronas glutamatérgicas y células pediátricas de glioma de alto grado en dispositivos microfluídicos para evaluar las interacciones eléctricas. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra la evaluación de la actividad eléctrica neuronal en un cocultivo de neuronas glutamatérgicas corticales derivadas de hiPSC y células de glioma utilizando un dispositivo microfluídico con matrices de electrodos múltiples.

Protocolo

>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Protocolo de co-cultivo

1. Ajustar el día de siembra y la concentración de las líneas celulares UW479 y BT35 para alcanzar el 80% de las células confluentes cuando debe comenzar el cocultivo, lo que corresponde a 21 días de cultivo para las neuronas glutamatérgicas.
2. Tripsinizar las células UW479 y BT35 y sembrarlas en la parte superior de las neuronas glutamatérgicas en cada dispositivo microfluídico dedicado (con una densidad objetivo de 900 células/^mm2 para cada tipo de célula) antes de sembrar las células de gliomas pediátricos de alto grado (pHGG) en el dispositivo microfluídico que contiene neuronas glutamatérgicas maduras.
3. Mantener los cocultivos durante 2 días en un ambiente controlado (37 °C, 5% CO₂) con neurona glutamatérgica Día 11 y medio en adelante detallado en la Tabla 1.
4. Cuente las células pHGG utilizando las imágenes microscópicas analizadas con software de análisis de imágenes para evaluar su viabilidad. Calcule el porcentaje de celdas.
   NOTA: Utilice la siguiente fórmula: 100 - ((número de celdas en D23 / número de celdas en D21) x 100).

>2. Registro electrofisiológico

1. Realizar el registro electrofisiológico con un sistema comercial y software disponible comercialmente.
   nota: Los experimentos se llevaron a cabo con una matriz de electrodos múltiples (MEA) que consistía en electrodos de 30 μm de diámetro espaciados por 100 μm.
2. Realizar un primer registro electrofisiológico de las neuronas glutamatérgicas en D21 antes de la siembra de las células pHGG. Utilice las neuronas glutamatérgicas diferenciadas como control y cultívelas solas en paralelo al cocultivo. Realice una segunda grabación para ambas condiciones como se describe en el siguiente paso numerado 3.
3. Realizar un segundo registro electrofisiológico en D23 (después de 2 días de cocultivo).

Tabla 1: Composición de los medios de cultivo para neuronas glutamatérgicas derivadas de hiPS.

inglés)

Componentes	Medio de siembra	D4 medio	D7 medio	D11 y medios posteriores
DMEM/F-12 Medio	0.5x	0.25x	0.125x	Ø
Medio Neurobasal	0.5x	0.25x	0.125x	Ø
Medio BrainPhys	Ø	0.5x	0.75x	1 vez
Suplemento SM1	1 vez	1 vez	1 vez	1 vez
Suplemento N2-A	1 vez	1 vez	1 vez	1 vez
Ala-Gln (GlutaMax)	0,5 mM	0,5 mM	0,5 mM	0,5 mM
BDNF	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
GDNF (en	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
TGF-β1	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL
Geltrex	30 μg/mL	Ø	Ø	Ø
Suplemento de siembra	1 vez	Ø	Ø	Ø
Suplemento Día 4	Ø	1 vez	Ø	Ø

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
256MEA100/30iR-ITO-s/o	Mcs	256MEA100/30iR-ITO-s/o
Sonda de 40 μm para contador Scepter	Dutscher	53750
Sonda de 60 μm para contador de cetro	Dutscher	51999
Ala -Gln (GlutaMAX)	sigma	G8541
Cabina de seguridad biológica de clase II	Termo Científico	HERASafe tipo KS12
Neuronas glutamatérgicas corticales	BrainXell	BX-0300
DMEM/F12 Medio	sigma	D8437
DPBS 1X	Dutscher	L0615-500
Matraces de cultivo celular EasYFlaskTM 75cm3	Nunc	156499
Suero fetal bovino (FBS)	Dutscher	500105
GDNF (en	Peprotech	450-10
Geltrex	Tecnologías de la Vida	A1413201
BDNF humano	Peprotech	450-02
incubadora	Memmert	IC0150med
MEA2100	Mcs	181205-MEA2100-11240
Micropipeta P10	sartorio	LH-729020
Micropipeta P100	sartorio	LH-729050
Micropipeta P1000	sartorio	LH-729070
Micropipeta P200	sartorio	LH-729060
Microtubo Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock	Dutscher	33290
Experimentador multicanal	Mcs	-
Suplemento N2-A	Célula madre	7152
Medio Neurobasal	Tecnologías de la Vida	21103049
Suplemento neuronal Neurocult SM1	Célula madre	5711
Aminoácidos no esenciales (NEAA) sin L-glutamina	Dutscher	X0557-100
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity	Drummond	4000202/4038202
Pipeta para cultivo celular 10 mL Falcon®	Dutscher	357551
Pipeta para cultivo celular 5 mL Falcon®	Dutscher	357543
Placa chófer (CultureTemp)	Belart	370151000
Poli-D-lisina	sigma	P6407
Microscopio Primovert	Zeiss	415510-1100-000

inglés)