Implantación de una guía de electrodos y fibra óptica en el hipocampo del ratón

Abstract

Fuente: Bender, F., et. al., Entrainment Optogenetic of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Ratones. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra la implantación estereotáctica de una guía de electrodos de alambre y una fibra óptica en el hipocampo de un modelo de ratón.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de fibras ópticas (Figura 1A)

1. Utilice fibra óptica multimodo (núcleo de 105 μm, revestido de vidrio con núcleo de sílice, 0,22 NA). Pele el revestimiento de 125 μm del núcleo de fibra con un micropelador mientras la fibra aún está unida al carrete de fibra.
2. Corta la fibra a una longitud de aproximadamente 2-3 cm con un cuchillo de diamante.
3. Inserte la fibra en una férula de varilla de cerámica de circonio (ID: 126 μm). Aproximadamente 0,5-1 mm de la fibra óptica deben sobresalir del lado convexo de la férula.
4. Con una aguja, aplique una gota de pegamento epoxi en ambos extremos de la férula, pero no en los lados de la férula. Alternativamente, use superpegamento.
5. Deja que el pegamento se seque durante al menos 30 minutos.
6. Pula el lado convexo de la férula con una película de pulido de fibra de diamante (granos de 3 μm).
7. Pruebe la fidelidad de la transferencia de luz con un medidor de potencia óptica.
   1. Ajuste la longitud de onda del medidor de potencia a la misma longitud de onda que el láser que se está utilizando.
   2. Coloque el cable de conexión con la punta hacia el centro del sensor. Encienda el láser y lea la salida de luz del medidor de potencia. Registre el valor.
   3. Conecte la fibra óptica al cable de conexión a través de un manguito de acoplamiento y colóquelo con la punta de la fibra hacia el centro del sensor. Encienda el láser y lea la salida de luz del medidor de potencia. Registre el valor.
   4. Calcule la velocidad de transmisión dividiendo el segundo valor por el primer valor. Si la velocidad de transmisión es inferior a 0,5, deseche la fibra; de lo contrario, utilícelo para la implantación.
   5. Pruebe la tasa de transmisión de cada fibra antes de la implantación.
   6. Para experimentos posteriores, ajuste la salida de intensidad de luz del láser a la velocidad de transmisión de la fibra óptica: Ajuste la salida de luz de la punta del cable de conexión a 5-15 dividida por la velocidad de transmisión para lograr una salida de luz final de la punta de fibra de 5-15 mW.

>2. Preparación de matrices de alambre de tungsteno para grabaciones LFP (Figura 1B)

1. Pegue varias (por ejemplo, 6) guías de tubo de sílice de 100 μm en paralelo al lado adhesivo de un trozo de cinta. Corte una pieza, de aproximadamente 4-6 mm, para un ensamblaje de matriz de cables.
2. Pase alambres de tungsteno de 45 μm aislados con var a través de los tubos guía con pinzas.
3. Pele seis cables de unión de cobre fino aislados con esmalte (aproximadamente 5 mm de largo) y un cable de conexión a tierra (de aproximadamente 2-3 cm de largo) usando un bisturí para raspar el aislamiento en ambos extremos. Suéldelos a los pines del nanoconector.
4. Conecte cada cable de unión a un cable de tungsteno con una gota de pintura conductora de plata, respectivamente. Deje secar durante al menos 30 minutos.
5. Aplique una cantidad mínima de cemento para cubrir los alambres. No aplique cemento a los cables de tungsteno, que se insertarán en el tejido cerebral, ni a la parte superior del nanoconector. Deja que el cemento se seque durante al menos 30 minutos.
6. Realice un corte angular (5-20°) de los alambres de tungsteno con tijeras romas de acero inoxidable para permitir la implantación confiable de alambres por debajo o por encima de la zona ventralmente adyacente al estrato piramidal, donde la amplitud theta es demasiado baja para estimar la fidelidad del arrastre.
7. Deaislante la punta (aproximadamente 2 mm) del cable de tierra usando un bisturí para raspar el aislamiento. Trátelo con fundente y presoldadura.
8. Compruebe las posibles diafonías entre electrodos utilizando un multímetro digital. Conecte las clavijas del conector al multímetro, que debe estar configurado en el modo de medición de resistencia. Compruebe las combinaciones de canales por pares; una lectura en el multímetro por debajo de 5 MΩ indica una diafonía significativa.
9. Utilice un medidor de impedancia para verificar la impedancia de cada electrodo de alambre en solución salina. Los valores típicos de impedancia están por debajo de 100 kΩ.
10. Para facilitar la implantación, pegue una fibra óptica a la matriz de cables de modo que la punta de la fibra esté al nivel del cable más corto y la punta de la fibra esté muy cerca pero sin tocar los cables de tungsteno. Mantenga el ángulo de la fibra lo más pequeño posible para evitar daños en los tejidos durante la implantación.

>3. Implantes estereotáxicos

1. Retire el tejido conectivo de la parte superior del cráneo y empuje completamente hacia abajo los músculos del cuello aproximadamente 2 mm para evitar artefactos musculares durante la grabación.
2. Limpiar el cráneo con un aplicador de punta de algodón y solución salina, y perforar cuatro orificios (2 en la parte delantera y dos por encima del cerebelo, de 0,8 mm de diámetro) para colocar tornillos de acero inoxidable óseo (00-96x1/16) para la fijación y estabilización del implante (Figura 1D). Coloque el tornillo de tierra, conectado a un cable de cobre (de aproximadamente 2-3 cm de longitud) por encima del cerebelo.
3. Cubra el tornillo de tierra completamente con cemento para evitar artefactos musculares durante los registros electrofisiológicos. Construya un anillo de cemento que conecte todos los tornillos (Figura 1E).
4. Realizar una craneotomía por encima del lado de implantación (Hipocampo, AP -1.94, L 1.4, V 1.4 en referencia al bregma). Aplique aproximadamente 5 μL de NaCl estéril en la superficie del tejido cerebral.
5. Baje lentamente el conjunto de cables utilizando estereotaxis en la craneotomía. Para grabaciones unitarias, implante una sonda de silicona en lugar de una matriz de cables. Para evitar artefactos de luz optoeléctrica, implante la fibra óptica por separado en el hipocampo con la punta de la fibra no directamente frente a la sonda (Figura 1C-I). Para investigar la coordinación del arrastre entre hemisferios, implante una fibra óptica adicional en el área CA1 del hipocampo contralateral.
6. Para proteger el tejido cerebral, aplique aproximadamente 5 μL de cera líquida tibia/aceite de parafina, precalentado a 70 °C, con una jeringa sobre el sitio de implantación.
7. Aplique cemento alrededor del conjunto de alambres y cubra el cráneo con cemento.
8. Aplique una gota de fundente al cable de tierra/referencia presoldado y al cable presoldado conectado al tornillo de tierra usando, por ejemplo, una aguja, y fusione los cables usando una máquina de soldar.
9. Cubra todo el cable de tierra con cemento.
10. Administrar 0,3 mL de Erycinum (1:4 en NaCl estéril) y carprofeno (5mg/mL) i.p. después de la cirugía y durante al menos los dos días siguientes. Por lo general, el ratón se despierta dentro de los 15 minutos posteriores a la cirugía. Calienta al animal con una lámpara roja para acelerar la recuperación.
11. Controle el peso del ratón diariamente durante la primera semana después de la cirugía o hasta que esté estable. La pérdida de peso no debe exceder el 10% del peso registrado del ratón antes de la cirugía. Para acelerar la estabilización del peso, suministre al ratón alimento húmedo y leche condensada durante los primeros días después de la cirugía.
12. Para registrar la actividad celular del hipocampo durante el arrastre, implante una sonda de silicona en el hipocampo (AP -1.94, L 1.4, V 1, con posterior descenso) (Figura 1C-I). Implantar la fibra óptica en el hipocampo a AP -3, L 1.4, V 1.6, 39° caudal-rostral. Si se desea la estimulación de los somas celulares, implantar una fibra óptica adicional en el MS (AP +0,98, L 1, V 3,9, 15° lateral).

Results

Figura 1: Ilustración de fibras ópticas, electrodos y cirugía. (A) Ilustración de una fibra óptica. (B) Ilustración de un conjunto de alambres pegados a una fibra óptica para el registro de la LFP del hipocampo durante el arrastre de las oscilaciones theta del hipocampo. (C) Para el registro de la actividad celular del hipocampo, se monta una sonda d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ratones PV-Cre	El Laboratorio Jackson	B6; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J
Estereotaxis	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE. UU.	Modelo 963	Instrumento estereotáxico ultrapreciso para pequeños animales
Brocas, 0,8 mm	Bijoutil, Allschwil, Suiza	49080HM
Estación de soldadura	Weller Tools GmbH, Besigheim, Alemania	WSD 81
eritromicina	Rotexmedica GmbH, Trittau, Alemania	PZN: 10823932	1 g de polvo para solución para perfusión
Taladro/amoladora de precisión	Proxxon, Wecker, Luxemburgo	FBS 240/E
Fibra óptica multimodo	ThorLabs, Dachau, Alemania	FG105LCA	0,22 NA, OH bajo, Ø105 μm Núcleo, 400 - 2400 nm
Casquillo de varilla de cerámica	Productos de fibra de precisión, Milpitas, CA, EE. UU.	CFLC126	Férula de cerámica LC MM, ID 126um
Papel de pulido	Thorlabs	LF3D	Hoja de lapeado de diamante (pulido) de 6" x 6"
Medidor de potencia	Thorlabs	PM100D	Consola compacta de medidor de potencia y energía, LCD digital de 4"
Acoplador de fibra óptica multimodo	Thorlabs	FCMM50-50A-FC	Acoplador 1x2 mm, relación de división 50:50, fibras GI de 50 μm, FC/PC
Latiguillo de fibra óptica	Thorlabs	FG105LCA MUC PERSONALIZADO	hecho a medida, 3 m de largo, con tubo protector, Tubo: FT030, Conector 1: FC/PC, Conector 2: Casquillo cerámico de 1,25 mm (LC)
manga	Productos de fibra de precisión, Milpitas, CA, EE. UU.	ADAL1	Manguito de acoplamiento dividido cerámico para casquillos de Ø1,25 mm (LC/PC)
Alambres de tungsteno	California Fine Wire Company, Grover Beach, CA, EE. UU.	CFW0010954	40 μm, 99,95%
Tubos capilares	Optrónica	1068150020	Diámetro interior: 100,4 μm
Nanoconector Omnetics	Omnetics Connector Corporation, Minneapolis, EE. UU.	A79038-001
Tornillos	Bilaney, Düsseldorf, Alemania	00-96x1/16	de acero inoxidable
Pintura conductora de plata	Conrad electronics, Alemania	530042
Fundente líquido	Felder GMBH Löttechnik, Oberhausen, Alemania	Lötöl ST	DIN EN 29454.1, 3.2.2.A (F-SW 11)