Control optogenético de la dinámica de la red del hipocampo

Resumen

Fuente: Manseau, F., et al. Afinación in vitro de la Banda Theta del Hipocampo: Metodologías para la Grabación del Circuito Septohipocampal de Roedores Aislados. J. Vis. Exp. (2017)

Este video demuestra el método para usar la optogenética para modular la dinámica de la red del hipocampo mediante la activación de interneuronas sensibles a la luz modificadas genéticamente en un corte de cerebro de ratón, mejorando la sincronización de la oscilación theta y estudiando el comportamiento de los circuitos neuronales.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran muestras de animales han sido revisados y aprobados por el comité de revisión ética animal apropiado.

1. Control optogenético en el hipocampo aislado
   NOTA: Para el control optogenético de la actividad de la red del hipocampo, se utiliza aquí una estrategia específica del tipo de célula que implica la activación rítmica de las células GABAérgicas que contienen PV (parvalbúmina positiva), ya que se demostró que estas células desempeñan un papel importante en la sincronización de las poblaciones celulares principales en el hipocampo aislado. La expresión selectiva del canal excitador rodopsina-2 (ChR2) en células PV se logra cruzando la línea de ratón PV-Cre con ratones que expresan constitutivamente ChR2 Cre-dependiente (Ai32), generando así ratones PV-ChY. Alternativamente, las construcciones de vectores virales (por ejemplo, AAVdj-ChETA-eYFP) se pueden inyectar en el hipocampo de ratones PV-Cre o PV-TOM (P15-16) para impulsar la expresión de la opsina excitatoria en las interneuronas CA1/SUB (Figura 1A).
   1. Coloque un electrodo LFP en el área CA1/SUB (Cornu ammonis-1/subiculum) y parchee una célula piramidal cercana en el hipocampo aislado de un ratón que expresa la opsina excitatoria ChR2 sensible a la luz azul en interneuronas PV.
   2. Coloque una guía de luz de fibra óptica (0,2 - 1 mm de diámetro) sobre la preparación del hipocampo y céntrela en la región registrada. Utilice la luz azul (473 nm) de una fuente LED para la estimulación optogenética, que consiste en pulsos de luz (10 - 20 ms, activados por una señal lógica de transistor-transistor) o comandos de voltaje de onda sinusoidal entregados a frecuencias theta (4 - 12 Hz).
   3. Cambie a la pinza amperimétrica y caracterice la actividad del piramidal durante las oscilaciones theta espontáneas.
   4. Inicie el protocolo de estimulación y registre las respuestas a la luz. Observe que las oscilaciones de campo y la actividad sináptica en la neurona registrada se sincronizan cada vez más durante la estimulación optogenética y que el ritmo rítmico de las células PV da como resultado un control robusto tanto de la frecuencia como de la potencia de las oscilaciones theta (Figura 1).

Resultados

Figura 1: Potencial de campo local y registros simultáneos de pinzas de parche de neuronas piramidales y PV CA1 / SUB individuales durante oscilaciones Theta espontáneas y optogenéticas en el hipocampo aislado.

(a) Diagrama que muestra los sitios de registro de LFP y electrodos de parche con la colocación de la guía de fibra ligera sobre la región CA1/SUB ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
cloruro de sodio	Sigma Aldrich	S9625
sacarosa	Sigma Aldrich	S9378
Bicarbonato de sodio	Sigma Aldrich	S5761
NaH2PO4 - fosfato de sodio monobásico	Sigma Aldrich	S8282
Sulfato de magnesio	Sigma Aldrich	M7506
Cloruro de potasio	Sigma Aldrich	P3911
D-(+)-Glucosa	Sigma Aldrich	G7528
Cloruro de calcio dihidratado	Sigma Aldrich	C5080
Ascorbato de sodio	Sigma Aldrich	A7631-25G
equipo
Mezcla de gases 95% O2/5% CO2 (carbógeno)	Vitalaire	SG466204A	sistema de perfusión
Botellas/frascos de vidrio (4 x 1 L)	N.D.	N.D.	sistema de perfusión
Cámara de grabación sumergida	diseño a medida (FM)	N.D.	Se puede utilizar una alternativa comercial
Amplificador de abrazadera de parche Multiclamp 700B	Dispositivos moleculares	ABRAZADERA MÚLTIPLE	electrofisiología
Multiclamp 700B Programa Commander	Dispositivos moleculares	ABRAZADERA MÚLTIPLE	electrofisiología
Convertidor digital/analógico	Dispositivos moleculares	DDI440	electrofisiología
Micromanipuladores (operados manualmente)	Siskiyou	MX130	electrofisiología (LFP)
Micromanipuladores (automatizados)	Siskiyou	MC1000e	Electrofisiología (parche)
Monitor de audio	Sistemas A-M	Modelo 3300	electrofisiología
Microscopio de fluorescencia vertical hecho a medida	Siskiyou	N.D.	imagenológico
Cámara de vídeo analógica	COHU	4912-2000/0000	imagenológico
Capturador de fotogramas digital con software de imagen	EPIX, Inc	PIXCI-SV7	imagenológico
Objetivo Olympus 2.5x	Olimpo	MPLFLN	imagenológico
Objetivo de inmersión en agua Olympus 40x	Olimpo	UIS2 LUMPLFLN	imagenológico
Sistema de diodos emisores de luz (LED) hecho a medida	costumbre	N.D.	estimulación optogenética (Amhilon et al., 2015)
animales
PV::Cre (KI) ratones	Laboratorio Jackson	Número de inventario 008069	Permitir la expresión génica dirigida por Cre en interneuronas PV
Ratones Ai9 constitutivos-condicionales (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	Laboratorio Jackson	Número de inventario 007905	Exprés TdTomato después de la recombinación mediada por Cre
Ratones Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	Laboratorio Jackson	Número de inventario 012569	Expresar la proteína de fusión canalrodopsina-2/EYFP mejorada tras la exposición a la recombinasa Cre
Ratones PVChY	Cría en casa	N.D.	Descendencia obtenida a partir del cruzamiento de la línea PV-Cre con ratones Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP