Evaluación de una unión neuromuscular funcional mediante estimulación óptica simultánea y grabación de vídeo

>Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparación del biorreactor

1. Fabricación de moldes para biorreactores
   1. Descargue un archivo CAD (diseño asistido por ordenador) de un biorreactor desde el archivo CAD complementario o cree un diseño personalizado.
   2. Genere una trayectoria CNC (Control Numérico por Computadora) a partir del modelo 3D utilizando el software CAM (fabricación asistida por computadora).
   3. Mecanizar moldes de acetal con una fresadora CNC.
2. Fabricación de biorreactores
   1. Mezcle una base 10:1 con una mezcla de agente de curado de polidimetilsiloxano (PDMS, 77 g de mezcla por 4 plataformas/moldes).
   2. Coloque la mezcla en una cámara de vacío, cierre todas las válvulas, encienda la aspiradora y desgasifique la mezcla durante al menos 30 minutos hasta que no queden burbujas de aire. Vierta la mezcla en moldes y desgasifique los moldes en la cámara de vacío durante 1 h.
   3. Cierre los moldes con la mitad superior del molde en la orientación correcta. Coloque una varilla hexagonal de acero sobre el centro y sujétela en ambos lados.
   4. Rellene la parte superior con PDMS.
   5. Cura los moldes en un horno a 65 °C durante al menos 4 h.
   6. Retire las plataformas de los moldes después de enfriarlas a temperatura ambiente.
   7. Limpie los dispositivos en un baño ultrasónico con ciclos de 1 h de jabón para platos, 400 ml de isopropanol al 100% y agua destilada.
   8. Secar toda la noche a 65 °C.
   9. Remoje los cubreobjetos de vidrio en poliol tensioactivo no iónico al 1% durante 30 minutos, asegurándose de que no se apilen para que todos estén correctamente recubiertos.
   10. Enjuagar bien con agua destilada y secar durante la noche a 65 °C.
   11. Trate los cubreobjetos de vidrio y la plataforma PDMS con un limpiador de plasma a temperatura alta con 6 L/min de oxígeno durante 1-2 min. Una vez tratados, unan los dos presionando el PDMS hacia abajo sobre el cubreobjetos durante al menos 30 s.
   12. Esterilizar en autoclave los dispositivos enlazados antes de añadir las células.

2. Construyendo una configuración de estimulación óptica

1. Usando un sistema de cubo de jaula de 30 mm, coloque un espejo dicroico de 573 nm en el centro. Acople un LED rojo (diodo emisor de luz) de 627 nm con un filtro de excitación de paso largo de 594 nm y conéctelo a la parte superior del cubo, con el LED mirando hacia el espejo. A continuación, conecte un LED azul de 488 nm con un filtro de excitación de paso corto de 546 nm al lado adyacente del cubo, con el LED orientado hacia el espejo como se muestra en el esquema de la Figura 1A.
2. Coloque un diafragma de iris accionado por anillo en la parte inferior del cubo de la jaula para controlar el tamaño del área iluminada.
3. Alimenta cada LED con un controlador y control LED T-Cube a través de una placa Arduino Uno Rev3. Conecte la entrada lateral del controlador LED a un enchufe de fuente de alimentación, conecte la salida central al Arduino y conecte la salida lateral directamente a los LED.
4. Conecte el Arduino Uno a una computadora con un cable USB.
5. Descargar archivos desde el enlace de GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. Abra el archivo "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" de la carpeta GitHub.
7. Establezca los parámetros de inicio: Steps = 30; startFrequency = 0.5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
8. Asegúrese de que la salida de pin 4 esté asignada al controlador de LED azul y la salida de pin 2 esté asignada al controlador de LED rojo. Compruebe que los cables centrales del controlador LED estén conectados a tierra y a la salida de pin respectiva.
9. Compile y cargue el programa "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" en Arduino.
10. Conecte cada controlador LED a su canal correspondiente.

>3. Configuración del cultivo celular (día -21-0)

1. Células primarias del músculo esquelético
   1. Descongele y expanda los mioblastos esqueléticos primarios (obtenidos de Cook Myosite) durante un máximo de seis pasos utilizando medio de crecimiento miotónico (+ suplemento). Mantenga las células en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
   2. Cambie el medio cada 2 días.
   3. Una vez que las células estén aproximadamente confluentes en un 60%, páselas con tripsina-EDTA al 0,05% (1x, durante 5 minutos a 37 °C). Recoja las células disociadas y agregue medios frescos para neutralizar la tripsina.
   4. Gire las células a 300 x g y aspire el sobrenadante por encima del gránulo de la celda.
   5. Resuspender las células con MGM y sembrar 1:3 con 60 mL por matraz de triple capa.
2. ChR2-hiPSC
   nota: Todas las líneas celulares para este trabajo fueron creadas y utilizadas de acuerdo con los lineamientos institucionales de la Universidad de Columbia, NY, EE.UU. En este protocolo, las hiPSCs que expresan ChR2 se generaron mediante la edición del genoma de CRISPR-Cas9 utilizando métodos previamente descritos18, pero cualquier línea celular optogenética estable (lentiviral, piggyBac, etc.) puede utilizarse de la misma manera. Se eligieron promotores constitutivos expresados tanto en iPSCs como en motoneuronas (CAG). Se encontró que las células tenían cariotipos sanos, como se señaló en publicaciones anteriores.
   1. Cubra las placas de 6 pocillos con 1 mL/pocillo de matriz de membrana basal solubilizada diluida en DMEM/F12 (1:80) e incube las placas a temperatura ambiente durante 1 h.
   2. Siembre iPSC en placas recubiertas de 6 pocillos con 2 mL de medio de cultivo celular libre de alimentador (medio iPSC), intercambiando 2 mL de medio cada dos días y pasando cada 5-7 días. Mantenga las celdas en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
   3. Fallecimiento
      1. Disocie las células madre incubándolas con 1 ml de reactivo liberador de células madre sin enzimas durante 4 minutos y cizallándolas mecánicamente con una pipeta P1000 de punta ancha.
      2. Células de siembra en una proporción de 1:24 o 1:48 en medios iPSC con 2 μM de diclorhidrato de Y-27632 en 2 mL/pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas.

>4. Siembra de tejido muscular esquelético (día -3)

1. Aísle y cuente 30 x 106 mioblastos utilizando un contador de células automatizado.
2. Resuspender los mioblastos en una mezcla 4:1 de 3 mg/mL de colágeno I y matriz de membrana basal solubilizada (800 μL de mezcla de colágeno + 200 μL de matriz de membrana basal para alcanzar un volumen final de 1 mL). Para el componente de colágeno, agregue el agente neutralizante adjunto (mezcla 9:1 de colágeno a agente neutralizante) y diluya la mezcla con 1x PBS para lograr un volumen de 800 μL.
3. Añada 15 μL de suspensión de colágeno celular a cada cámara muscular del biorreactor, asegurándose de distribuir la suspensión por ambos pilares con la punta de la pipeta (Figura 2).
4. Deje que la mezcla de célula y gel polimerice a 37 °C durante 30 minutos y luego llene bien cada biorreactor con 450 μL de medio de crecimiento miotónico.
5. A los 3 días (una vez que el gel se haya compactado), comience la diferenciación de miotubos.

5. Diferenciación de miotubos (días 0-14)

1. Iniciar la infusión del miotubo cambiando los tejidos a 450 μL de medio inductor de fusión (FS, Tabla 1) durante 7 días, cambiando el medio cada dos días.
   nota: Intente comenzar la diferenciación de miotubos el mismo día que la diferenciación de motoneuronas de hiPSC para sembrar motoneuronas al final de los programas de diferenciación de ambos tipos de células.
2. El día 7 cambie el medio a 450 μL de medio de maduración Ia (MMIa, Tabla 1).
3. En el día 9, cambie a 450 μL de medio de maduración Ib (MMIb, Tabla 1).
4. El día 11, cambie el medio a 450 μL de NbActiv4. Siga cambiando el medio cada 2 días hasta que se siembren las motoneuronas (Paso 7).

6. Diferenciación de motoneuronas (días 0-14)

1. En el día 0, transfiera 4 x 10⁶ ChR2- hiPSC a una placa de Petri de fijación ultra baja con 15 mL de medio de cultivo en suspensión de motoneuron (MSCM, Tabla 1). Complemente MSCM con 3 μM de CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM de hidrato de SB431542 y 5 μM de diclorhidrato de Y-27632.
2. En el día 2, aísle las neuroesferas (NS) con un filtro reversible de 37 μM y vuelva a colocar 15 mL de MSCM con 3 μM de CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrato y 0,1 μM de ácido retinoico. Después del día 2, el NS debe ser visible en la placa de Petri sin usar un microscopio.
3. El día 4, transfiera las células y los medios a un tubo de 50 ml y deje que las neuroesferas se asienten en el fondo (5 min). Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 15 mL de MSCM suplementado con 0,5 μM de SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 y 0,1 μM de ácido retinoico.
4. El día 7, repita el paso 6.3 pero vuelva a suspender las células en 15 ml de MSCM suplementado con 0,5 μM de SAG y 0,1 μM de ácido retinoico.
5. El día 9, repita el paso 6.3, pero vuelva a suspender las células en 15 mL de MSCM suplementado con 10 μM de DAPT.
6. El día 11, repita el paso 6.3 pero vuelva a suspender las células en 15 mL de MSCM suplementado con 20 ng/mL de BDNF y 10 ng/mL de GDNF.
7. El día 14, siembra las motoneuronas en la plataforma.

>7. Siembra de agregados de motoneuronas en el biorreactor (día 14)

1. Prepare una mezcla de gel 4:1 de 2 mg/mL de colágeno I y Matrigel (800 μL de mezcla de colágeno + 200 μL de Matrigel para alcanzar un volumen final de 1 mL). Para el componente de colágeno, agregue el agente neutralizante adjunto (mezcla 9:1 de colágeno a agente neutralizante) y diluya la mezcla con 1x PBS para lograr un volumen final de 800 μL.
2. Utilice un filtro de células de 400 nm para seleccionar neuroesferas grandes y resuspenderlas en la mezcla de gel.
3. Aspire los medios del reservorio y con cuidado del pocillo de la neurosfera (Figura 2).
4. Agregue 15 μL de mezcla de gel en el canal de la neurosfera.
5. Cargue una pipeta de 10 μL con 10 μL de gel y, a continuación, elija una neurosfera.
6. Deposite el SN en el canal de la neurosfera y asegúrese de que el NS esté en la cámara. Levante lentamente la pipeta mientras libera el gel restante una vez que se deposita el NS. Si no está seguro de que el NS se depositó correctamente, verifique su ubicación con un microscopio.
7. Deje que el gel polimerice durante 30 minutos a 37 °C.
8. A los depósitos, añadir 450 μL de NbActiv4 suplementado con 20 ng/mL de BDNF y 10 ng/mL de GDNF.
9. Cambie el medio cada dos días para permitir el crecimiento axonal del SN al tejido muscular.

8. Estimulación óptica simultánea y grabación de vídeo de la función NMJ (día 24+)

1. Para la obtención de imágenes, utilice un microscopio fluorescente invertido con una cámara científica complementaria de semiconductores de óxido metálico (sCMOS).
2. Configure la agrupación del software de la cámara en 2x2, la exposición en 20 ms, el rolling shutter activado, la velocidad de lectura en 540 MHz, el rango dinámico: 12 bits y ganancia 1, y el modo del sensor: superposición.
3. Utilice el objetivo 2x en el microscopio para obtener imágenes de los microtejidos.
4. Coloque una cámara de células vivas (37 °C, 5% de CO₂) en la platina del microscopio.
5. Seleccione la región de interés (ROI) que contiene el tejido esquelético inervado para minimizar el tamaño del archivo y el tiempo de procesamiento.
6. Coloque un filtro de emisión de paso largo de 594 nm entre la muestra y el objetivo de imagen para filtrar los pulsos de luz azul de la cámara.
7. Coloque una placa rectangular de 4 pocillos que contenga 4 biorreactores (24 tejidos) en la cámara de células vivas.
8. Haga clic en Vista en vivo. Centrar y enfocar la imagen con el ROI deseado.
9. Cargue el código de macro personalizado desde la carpeta GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) para controlar la posición del escenario, la placa Arduino y la adquisición de vídeo.
10. Establezca la película de salida como day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. Ejecute el código de macro con las coordenadas X,Y deseadas establecidas en el escenario y adquiera un lapso de tiempo rápido con 1700 fotogramas a 50 fotogramas/s.
12. Reemplace el medio después de la toma de imágenes y devuelva las muestras a la incubadora. Espere al menos 24 h entre sesiones de adquisición de imágenes para evitar la fatiga de los tejidos.

Figura 1. Estimulación, registro y análisis de la función de la NMJ. (A) Esquema de la configuración del LED y la trayectoria de la luz. (B) Configuración óptica con un microscopio invertido, cámara de células vivas, platina automatizada y cámara sCMOS. (C) Algoritmo para el procesamiento por lotes de videos de estimulación óptica de cultivos NMJ. (D) El fotograma representativo del vídeo generado por el código de MATLAB y el gráfico de trazas de contractilidad correspondiente. El cuadro azul parpadeante en el video y las líneas verticales en el gráfico indican cuándo se produce la estimulación de la luz azul.

Figura 2. Sistemas de co-cultivo para la generación de NMJs 3D. (A) Esquema de la plataforma microfluídica. B) Esquema del biorreactor PDMS de pozo abierto. (C) Tejido muscular esquelético inervado en la plataforma microfluídica. (D) Tejido inervado en el biorreactor de pozo abierto. Barra de escala 0,5 mm.

Tabla 1. Formulaciones de medios miogénicos y neuronales. Lista organizada de factores de crecimiento y suplementos para los medios de comunicación.